论文部分内容阅读
第一部分地氟醚预处理对脐静脉内皮细胞缺氧/复氧损伤的保护作用目的:分离培养原代人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs),研究地氟醚预处理对HUVECs缺氧/复氧损伤所起的保护作用。方法:采用胶原酶灌注消化法分离培养HUVECs,以Ⅷ因子相关抗原免疫荧光方法进行鉴定。将细胞分为三组:对照组(CON组),缺氧/复氧组(A/R组)和地氟醚预处理组(DesPC组),DesPC组在缺氧/复氧损伤前先给予30分钟1MAC地氟醚处理。用异硫氰酸荧光素标记的重组膜粘连蛋白-5(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)标记,流式细胞仪计数凋亡细胞,四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定细胞存活率,采用WST-1(water-soluble tetrazolium salt)法测定细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活力。结果:原代HUVECs生长5-7天后呈单层铺路石样排列,细胞为扁平多角形,Ⅷ因子相关抗原检测为阳性。A/R组细胞凋亡率(35.73±5.43%,均数±标准差)与CON组(23.62±4.56%)相比明显增加,经过地氟醚预处理后,DesPC组细胞凋亡(27。39±3.22%)较A/R组明显下降。DesPC组细胞存活率(96.58±6.25%)明显高于A/R组(86.25±3.61%)。A/R组细胞内SOD活力(23.55±7.84U/mgprotein)较CON组(38.86±6.40U/mgprotein)降低,DesPC组SOD活力(35.49±9,36U/mgprotein)与A/R组相比明显增加。结论:本实验成功培养出原代HUVECs,建立了体外缺氧/复氧模型。地氟醚预处理抑制脐静脉内皮细胞缺氧/复氧引起的细胞凋亡,保存细胞内超氧化物歧化酶活性,从而具有一定的抗缺氧/复氧损伤效应。第二部分地氟醚预处理引起脐静脉内皮细胞转录因子NF-κB振荡和抗凋亡蛋白产生目的:转录因子NF-κB参与调节吸入麻醉药物预处理引起的缺氧/复氧损伤保护作用。探讨地氟醚预处理对HUVECs NF-κB以及凋亡相关蛋白表达的影响,以明确地氟醚预处理对缺氧/复氧损伤的保护机制。方法:选用原代培养的HUVECs,将细胞分成6组:对照组(CON组),地氟醚组(DES组),缺氧/复氧组(A/R组),地氟醚预处理组(DesPC组),BAY+DesPC组和BAY+A/R组,DesPC在A/R前给予30分钟1MAC地氟醚处理,DES组给予地氟醚处理但不经历A/R损伤,BAY+DesPC组和BAY+A/R组分别在气体处理前给予抑带剂BAY117082。利用annexin V-FITC标记,流式细胞仪计数凋亡细胞以及MTT法测定细胞存活率。免疫荧光方法标记NF-κB p65核转运,Western blot方法测细胞凋亡抑制蛋白1(c-IAP1)、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶-3(caspase-3)、NF-kappa B抑制因子ⅠκBα和磷酸化NF-κB p65(p-p65)的表达量。结果:免疫荧光方法显示,对照组NF-κB p65免疫荧光标记主要分布在胞浆区,DES组细胞在地氟醚处理结束后立即出现NF-κB p65入核转运。Western blot方法检测DES组ⅠκBα含量较对照组下降,磷酸化NF-κB p65增加,A/R组与对照组相比磷酸化NF-κB p65显著增加。DesPC组经过地氟醚预处理的细胞ⅠκBα含量较A/R组增加,NF-κB p65磷酸化减少,同时c-IAP1、Bcl-2蛋白和caspase-3前体的蛋白含量也明显增加。BAY+DesPC组和BAY+A/R组细胞存活率、凋亡率无明显差异,细胞内ⅠκBα含量、NF-κB p65磷酸化和caspase-3前体含量均无明显差异。结论:实验结果显示地氟醚在预处理阶段激活NF-κB并且通过负反馈抑制复氧阶段NF-κB的过度激活。地氟醚引起的NF-κB的振荡最终上调了内皮细胞中抗凋亡蛋白的表达,从而产生对抗A/R损伤的保护作用。