【摘 要】
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L-高丝氨酸虽然不参与蛋白质的合成,属于非必须氨基酸,但它是L-苏氨酸、L-蛋氨酸、L-异亮氨酸的合成前体,在医药、农业、化工领域都具有十分重要的应用价值。目前L-高丝氨酸的工业化生产,主要依赖于化学合成法,化学合成法存在污染高、产物纯度低、耗时长等缺点。与化学法相比微生物发酵法符合绿色发展需求,是未来工业化生产L-高丝氨酸的趋势。微生物法生产L-高丝氨酸的相关研究主要以大肠杆菌（Escheric
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L-高丝氨酸虽然不参与蛋白质的合成,属于非必须氨基酸,但它是L-苏氨酸、L-蛋氨酸、L-异亮氨酸的合成前体,在医药、农业、化工领域都具有十分重要的应用价值。目前L-高丝氨酸的工业化生产,主要依赖于化学合成法,化学合成法存在污染高、产物纯度低、耗时长等缺点。与化学法相比微生物发酵法符合绿色发展需求,是未来工业化生产L-高丝氨酸的趋势。微生物法生产L-高丝氨酸的相关研究主要以大肠杆菌（Escherichia coli）为底盘菌株,但谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）作为一种主要工业生产菌株,在发酵过程中可以利用较廉价的底物发酵生产,安全性较高,对人和动物体不具备致病性,适用于氨基酸的合成,已被用于生产多种氨基酸及各种重要的化合物,具有十分重要的研究价值。本研究以C.glutamicum ATCC13032为出发菌株,首先利用谷氨酸棒状杆菌常用的基因编辑工具敲除编码L-高丝氨酸激酶的thr B基因,从而阻断了谷氨酸棒状杆菌中L-高丝氨酸向L-苏氨酸转化的代谢途径,成功构建thr B缺失菌株C.glutamicum H1,野生菌发酵液及菌株的胞内均没有发现L-高丝氨酸积累,C.glutamicum H1发酵液中能够积累少量的L-高丝氨酸。利用不同规格的摇瓶,改变培养基中的溶氧环境,检测在不同的溶氧环境下C.glutamicum H1发酵液中L-高丝氨酸浓度以及菌体浓度。结果发现在普通摇瓶中L-高丝氨酸的浓度为44.6 mg/L,挡板摇瓶中L-高丝氨酸的浓度为861.8 mg/L,L-高丝氨酸的产量提高了近20倍;在普通摇瓶中菌体的浓度OD600为16.03,挡板摇瓶中菌体浓度OD600为46.4,菌体浓度提高了2倍。在高溶氧环境下,L-高丝氨酸产量和菌体浓度均有较大的提升,表明高溶氧量对提高L-高丝氨酸的产量至关重要。在C.glutamicum H1菌株中,通过过表达大肠杆菌来源的解除了苏氨酸反馈抑制的编码天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶双功能酶基因thr A的突变体thr AFbr（Fbr,抗反馈抑制）,增强了C.glutamicum H1中L-高丝氨酸合成的碳代谢流,使菌株代谢过程中更多的碳源能够转化为L-高丝氨酸,来进一步提高C.glutamicum H1的L-高丝氨酸产量。通过验证不同浓度诱导剂诱导条件下发酵液中L-高丝氨酸的浓度,得出工程菌发酵过程中最适的IPTG诱导浓度为1 mmol/L,在该浓度下,诱导质粒表达可以有效的提升L-高丝氨酸的产量,通过摇瓶发酵,发酵液中L-高丝氨酸的浓度为8.09 g/L,提高了近13倍。通过比较来自谷氨酸棒状杆菌Rht B家族运输蛋白编码基因中的NCgl0143、NCgl2262、NCgl2566、双组分转运蛋白Brn EF的编码基因,以及来源于大肠杆菌的氨基酸转运蛋白Rht A编码基因,发现大肠杆菌的氨基酸转运蛋白Rht A过表达对L-高丝氨酸产量的提升最为显著,过表达Rht A后发酵液中L-高丝氨酸的浓度提高了11%。通过20 L发酵罐补料发酵的放大培养,通过控制发酵条件,使得L-高丝氨酸的产量达到了15.28 g/L,与摇瓶相比产量提高了近70%。
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