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目的:前期通过关联ARROWSMITH文献工具分析,发现心血管系统疾病治疗中,黄芪与维生素D之间包含了非常有价值的隐性规则。提出黄芪皂苷在心血管疾病治疗中可能通过维生素D系统对肾素的调控,进而抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统激活的分子机制。拟运用内皮素-1诱导细胞肥大模型,结合siRNA技术,探讨黄芪皂苷对心肌细胞维生素D系统的调节作用,从而调控肾素的表达在心肌肥厚治疗中的作用机制,为中医药预防和治疗充血性心力衰竭提供新的治疗靶点和新的思路。方法:1.原代心肌细胞培养:取24h-27h内的新生SD乳鼠,胰酶消化法,获得新生大鼠的原代心肌细胞,并运用α-actin免疫组化进行心肌细胞鉴定。2.黄芪皂苷对内皮素-1诱导的心肌细胞肥大模型VDR、CYP27B、CYP24A、肾素表达的影响:细胞分组为对照组,模型组(内皮素-1,10-8mol/L),维生素D组(内皮素-1,10-8mol/L,维生素D,10-8mmol/L),黄芪皂苷低剂量组(内皮素-1,10-8mmol/L,黄芪皂苷,10μg/ml),黄芪皂苷中剂量组(内皮素-1,10-8mol/L,黄芪皂苷,20μg/ml),黄芪皂苷高剂量组(内皮素-1,10-8mol/L,黄芪皂苷,40μg/ml),分组处理细胞,干预24h后,收集细胞。qRT-PCR 及 westernblot 检测 VDR、CYP27B、CYP24A、ReninmRNA及蛋白表达。3.慢病毒VDRsiRNA质粒的构建及心肌细胞转染:按照siRNA设计原则,设计VDRsiRNA序列,通过在细菌体内同源重组的方法构建VDR基因的siRNA慢病毒载体,将LV3-VDRRNAi转染293T细胞,获取病毒滴度达到1×108TU/ml。然后转染心肌细胞,并用RT-PCR检测VDR基因沉默的效率。4.黄芪皂苷对内皮素-1诱导的VDRsiRNA心肌细胞肥大模型CYP27B、CYP24A、肾素表达的影响:分组:对照组(Ctrl),VDRsiRNA阴性组(Neg),VDRsiRNA组(Ko),VDRsiRNA+内皮素-1 组(内皮素-1,10-8mol/L,ET-1),VDRsiRNA+内皮素-1+维生素D 组(内皮素-1,10-8mol/L,维生素 D,10-8mmol/L,VD),VDRsiRNA+内皮素-1+黄芪皂苷低剂量组(内皮素-1,10-8mol/L,黄芪皂苷,10μg/ml,Low),VDRsiRNA+内皮素-1+黄芪皂苷中剂量组(内皮素-1,10-8mol/L,黄芪皂苷,20μg/ml,Mid),VDRsiRNA+内皮素-1+黄芪皂苷高剂量组(内皮素-1,10-8mol/L,黄芪皂苷,40μg/ml,Hig),分别处理细胞,干预 24h 后,收集细胞。qRT-PCR 及 westernblot 检测 CYP27B、CYP24A、Renin mRNA及蛋白表达。5.黄芪皂苷对内皮素-1诱导的心肌细胞肥大模型凋亡的影响:流式细胞仪检测黄芪皂苷对心肌细胞VDRsiRNA前后凋亡的影响。6.黄芪皂苷对内皮素-1诱导的心肌细胞肥大模型超微结构的影响:电镜检测黄芪皂苷对心肌细胞VDRsiRNA前后超微结构的影响。结果:1.原代心肌细胞培养:α-actin染色鉴定心肌细胞,细胞胞浆有褐色致密颗粒,为心肌细胞染色的特征。2.黄芪皂苷对内皮素-1诱导的心肌肥大模型VDR、CYP27B、CYP24A、肾素表达的影响:1)与对照组比较,内皮素-1(ET-1)模型组VDR、CYP27BmRNA表达降低(P<0.01);模型组CYP24A与Renin,mRNA表达则升高(P<0.05)。与模型组比较,维生素D干预组VDR、CYP27B mRNA的表达上调,黄芪皂苷高剂量组VDR与CYP27B mRNA表达上调(P<0.05)。与模型组比较,维生素D干预组Renin与CYP24AmRNA的表达下调(P<0.05),黄芪皂苷高剂量组、中剂量组Renin及CYP24A mRNA的表达下调(P<0.05)。2)与对照组比较,内皮素(ET-1)模型组的VDR、CYP27B蛋白表达显著降低(P<0.05),CYP24A、Renin蛋白表达升高(P<0.05)。与模型组比较,维生素D组、黄芪皂苷高剂量组干预可以显著上调模型组心肌细胞的VDR与CYP27B蛋白的表达(p<0.05),维生素D组、黄芪皂苷高剂量组、中剂量组干预显著下调CYP24A与RENIN蛋白的表达(p<0.05)。3.慢病毒VDRsiRNA质粒的构建:通过在细菌体内同源重组的方法构建VDR基因的siRNA慢病毒载体,将LV3-VDRRNAi转染293T细胞,滴度达到1×108TU/ml,然后转染心肌细胞,qRT-PCR证实能够有效的抑制VDR的表达,使心肌细胞VDRmRNA的表达率下降72%,LV3-VDR RNAi能高效干扰心肌细胞VDR表达。RNAi阴性对照组转染的效率与RNAi相当,但不影响VDR的表达。4.黄芪皂苷对内皮素-1诱导的VDRsiRNA心肌肥大模型CYP27B、CYP24A、肾素表达的影响:1)与对照组比较,VDRsiRNA心肌细胞CYP27BmRNA表达下调趋势,但无统计学意义(P>0.05);CYP24AmRNA及ReninmRNA表达上调(P<0.05);2)与VDRsiRNA心肌细胞组比较,内皮素-1(ET-1)诱导VDRsiRNA心肌细胞组(ET-1组)CYP27BmRNA 表达进一步下调(P<0.05),CYP24AmRNA、ReninmRNA 表达上调(P<0.05)。3)与ET-1组比较,维生素D组、黄芪皂苷高剂量组能上调CYP27B mRNA的表达(P<0.05),下调ReninmRNA的表达(P<0.05)。4)与对照组比较,VDRsiRNA心肌细胞CYP27B蛋白表达下调,CYP24A蛋白及Renin蛋白表达上调(P<0.05);5)与VDRsiRNA组比较,内皮素(ET-1)组的CYP27B蛋白表达显著降低(P<0.05),CYP24A与Renin蛋白的表达则显著上调(P<0.05)。维生素D组、黄芪皂苷高剂量组能显著上调内皮素-1(ET-1)诱导的心肌细胞VDRsiRNA的CYP27B蛋白的表达,维生素D组下调Renin、CYP24A蛋白表达(P<0.05);黄芪皂苷对Renin、CYP24A蛋白表达具有下调趋势(P>0.05)。5.黄芪皂苷对内皮素-1诱导的VDRsiRNA前后心肌细胞肥大模型凋亡的影响:1)与对照组比较,内皮素1(ET-1)诱导的心肌细胞肥大模型组,心肌细胞凋亡率明显增加(P<0.05)。与模型组比较,维生素D干预组、黄芪皂苷高、中剂量干预组心肌细胞凋亡率降低(P><0.05)。与模型组比较,黄芪皂苷低剂量组心肌细胞凋亡率凋亡率与模型组比较未见差异性(P>0.05)。2)与正常组比较,VDRsiRNA组凋亡增加,VDRsiRNA+内皮素(ET-1)诱导后心肌细胞凋亡率显著提高(P<0.05)。维生素D组、黄芪皂苷高、中剂量组干预后,可以有效抑制心肌细胞的凋亡(P<0.05)。6.黄芪皂苷对内皮素-1诱导的VDRsiRNA前后心肌细胞肥大模型超微结构的影响:1)电镜下可见对照组心肌细胞形态正常细胞模完整,线粒体等细胞器数量正常,胞核清晰完整;ET-1模型组细胞整体形态不规则,线粒体显著增多且结构紊乱,细胞核界限紊乱,染色质形态异常;维生素D组、黄芪皂苷高、中剂量组干预后,细胞整体形态改善,线粒体数量结构相对正常,凋亡小体相对减少,核膜完整,整体细胞损伤减轻。低剂量组改善不明显。2)与对照组比较,对照组心肌细胞形态正常细胞模完整,线粒体等细胞器数量正常,胞核清晰完整;VDRsiRNA组可见线粒体整体数量减少,结构尚可,核膜尚完整;VDRsiRNA心肌细胞ET-1模型组细胞整体不规则,线粒体增多变大且结构紊乱,细胞核界限紊乱,染色质较散乱;维生素D组、黄芪皂苷高、中剂量组干预后心肌细胞整体形态改善,线粒体大小结构相对正常,凋亡小体相对减少,核膜完整清晰,染色质形态尚规则。结论:1.维生素D系统(维生素D受体、CYP27B、CYP24A)参与内皮素-1诱导心肌细胞肥大的病理生理过程中。2.黄芪皂苷具有保护内皮素-1诱导的心肌细胞肥大作用,部分作用是通过对心肌细胞维生素D系统的调节,而抑制肾素的表达,从源头阻断肾素-血管紧张素-醛固酮系统的激活。3.黄芪皂苷通过维生素D系统抑制内皮素-1诱导的心肌细胞凋亡,保护心肌细胞的超微结构。