CRKs（CDPK-related kinases）是最接近CDPKs家族的激酶,可能在介导植物耐逆过程中发挥一定作用。然而,目前尚未报道其是否在植物耐盐中发挥作用。本研究以拟南芥为研究材料,克隆钙依赖蛋白激酶相关激酶基因AtCRK5,并对其进行功能研究,在生理和分子水平上初步探明AtCRK5在拟南芥抗盐中的作用机制。结果如下:1.拟南芥AtCRK5基因克隆、生物信息学分析及亚细胞定位对AtCRK5基因及编码氨基酸序列进行生物信息学预测分析,结果表明AtCRK5含CDS序列1806 bp,可编码601个氨基酸,具有典型的S-TKc激酶结构域。AtCRK5蛋白呈亲水性,属于不稳定蛋白,且蛋白无跨膜区,无信号肽。二级结构分析显示无规卷曲是占比例最高的结构元件,延伸链最少。通过分析CRK5基因在盐处理下的表达模式,不管是拟南芥AtCRK5,还是盐生植物盐地碱蓬Ss CRK5基因,均在盐处理后表达上调。由此推测AtCRK5基因可能在应对早期盐胁迫过程中发挥重要作用。根据拟南芥AtCRK5基因序列设计引物,克隆得到拟南芥AtCRK5基因CDS序列,长度为1806 bp,并且构建了p CAMBIA1307-35S-AtCRK5-MYC表达载体。同时构建p CAMBIA2300-35S-AtCRK5-GFP表达载体,采用烟草瞬时转化法检测AtCRK5蛋白在细胞内的表达定位,初步探明AtCRK5在质膜上定位。2.拟南芥AtCRK5过表达与拟南芥crk5突变体株系的获得在拟南芥中过表达AtCRK5并研究其功能。采用农杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥,使用潮霉素筛选转基因阳性苗,分别在DNA和RNA水平验证过表达株系的可靠性。对获得的纯合过表达株系进行q RT-PCR。检测结果显示,过表株达系中AtCRK5基因均不同程度地表达上调。最后筛选出生长状态较好的转基因株系A3和A11。使用三引物法鉴定T-DNA插入突变体crk5（SALK＿024198C）。通过qRT-PCR分析,发现AtCRK5在突变体株系的表达量明显降低。3.盐胁迫下拟南芥AtCRK5基因的功能分析用一定浓度梯度的NaCl处理野生型拟南芥（WT）,过表达株系以及突变体crk5。10d后测量各株系根长。结果显示,与对照组相比,盐处理后的拟南芥各株系根系生长均受到不同程度的抑制,而突变体株系受到的抑制最明显,过表达株系A3和A11相对于其他株系长势较好。不同浓度NaCl处理拟南芥各株系种子,发现盐处理对各株系种子萌发的影响没有差异。将1月龄拟南芥各株系分别用0和100 mM NaCl处理14 d,测定各株系的生物量和叶绿素含量。结果表明,突变体株系在施加NaCl后受到的损伤最严重,表现为叶绿素含量明显下降,生物量积累显著降低。相对于突变体株系,WT和过表达株系受损程度相对较低,且过表达株系表现出来的耐盐能力优于WT。说明AtCRK5在介导拟南芥耐盐过程中发挥重要作用。q RT-PCR结果显示,AtCRK5过表达株系中盐响应相关基因AtPOD、AtSOD、AtAPX、AtCAT、AtSOS1和AtHKT1上调显著,推测AtCRK5可能介导了拟南芥与维持离子稳态和抗氧化酶相关基因的表达,从而在拟南芥耐盐中发挥正调控作用。