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2010年首次在小鼠上发现新型NOD样受体NLRC5基因,NLRC5是NLR家族最大的成员,大量研究表明NLRC5在固有免疫和获得性免疫中有重要的作用,但其自身的调控机制尚不明了,因此为了探究NLRC5基因启动子自身调控原理,本研究首先检测了鸡NLRC5基因在鸡不同组织中的表达特异性,利用软件预测NLRC5启动子区的CpG岛,并通过亚硫酸氢盐修饰后BSP检测DF1和HD11细胞中NLRC5启动子区的甲基化状态,利用甲基化转移酶抑制剂5-aza-cd处理细胞,比较甲基化程度与基因表达的关系,并最终通过启动子竞争结合转录因子实验、定点突变实验、凝胶迁移实验的方法来验证甲基化影响基因表达的转录因子。克隆了NLRC 起始密码子前2265 bp的启动子区,构建启动子区系列缺失载体,转染DF1细胞,根据双荧光素酶实验确定不同缺失片段活性高低从而确定关键调控区域,预测分析关键调控区域内可能存在的反式作用元件,利用启动子竞争结合转录因子实验、定点突变实验、凝胶迁移实验的方法来验证顺式元件及对NLRC5启动子活性的影响。最后通过LPS和IFN-y处理HD11细胞,RT-qPCR以及ELISA确定NF-κB激活条件,并验证鸡NLRC5基因启动子区NF-κB顺式作用元件,结果表明:1.RT-qPCR检测到NLRC5在鸡脾脏、肝脏等免疫相关组织的表达量显著高于心脏、肌肉等组织,并且检测NLRC5基因在鸡巨噬细胞系HD11中的表达量显著高于鸡成纤维细胞系DF-1。2.为探讨NLRC5启动子区的甲基化对转录水平的影响进行了一系列实验,其中MethPrimer 预测发现 2 个 CpG 岛:-4060 到-3428,共 663 bp 和-3344 到-3027,共 318 bp;BSP实验结果表明DF1处于高甲基化状态,而HD11甲基化水平较低,利用不同浓度甲基化转移酶抑制剂5-aza-cd处理两种细胞,CCK-8检测细胞存活率,定量检测相关基因的表达,发现40μmol/L终浓度5-aza-cd处理条件下,细胞DF-1存活率相比对照组差异极显著(P<0.01),并对处理细胞进行甲基化检测发现具体甲基化降低位点。并最终构建该区域缺失载体转染双荧光素酶实验、启动子结合转录因子实验、定点突变实验、凝胶迁移实验的方法确定甲基化通过E2F转录因子影响NLRC5基因的转录调控。3.为寻找NLRC5启动子-2265到-1区域的潜在调控元件,利用JASPAR软件分析发现NLRC5启动子-2265到-1间可能存在的转录因子结合位点,构建缺失载体进行双荧光素酶实验确定三个活性较高的区域,启动子竞争结合转录因子实验发现在-459区域存在STAT1转录因子,针对该核心区域的顺式元件STAT1的点突变和凝胶迁移实验进一步确认了该区域内存在STAT1顺式元件,其在NLRC5基因启动子活性调控过程中能够发挥重要作用。4.为寻找NLRC5启动子区的NF-κB转录因子结合位点。利用过表达结合缺失载体确定NF-κB可能结合区域,利用脂多糖(LPS)和干扰素γ(IFN-γ)刺激鸡巨噬细胞HD11,发现10ng/mlLPS刺激8小时和1ng/mlLPS+10ng/mlIFN-γ刺激12小时能有效激活细胞中的NF-κB,最终EMSA验证-2423和-2342存在两个NF-κB反式作用元件。