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第一部分TNF-α在大鼠椎间盘退变过程中扮演的角色目的:明确TNF-α在大鼠椎间盘退变过程中发挥的生物学作用。方法:不同剂量外源性TNF-α注射大鼠尾椎椎间盘。一月后行MRI平扫检测椎间盘影像学表现,HE染色观察椎间盘细胞成分及形态演变,甲苯胺蓝染色观察蛋白聚糖表达,免疫组化观察Ⅱ型胶原表达变化情况。明确TNF-α在椎间盘退变过程中发挥的作用。结果:外源性TNF-α注射一月后,MR平扫发现椎间盘T2信号强度减低,椎间盘高度降低。HE染色观察发现正常椎间盘中髓核区域细胞和细胞外基质分布较均匀,纤维环层状分布,结构清晰;实验组大鼠尾椎间盘髓核区域细胞数量明显减少,分布不均,细胞外基质紊乱;纤维环层状结构排列紊乱和撕裂,髓核基质和细胞嵌入纤维环。甲苯胺蓝染色及免疫组化结果提示实验组髓核中细胞数量减少,蛋白聚糖和Ⅱ型胶原表达明显降低。结论:TNF-α可以诱导髓核细胞凋亡,加速细胞外基质降解,是一个导致椎间盘退变的重要早期致病因素。第二部分内质网应激影响髓核细胞在炎症微环境中的生物学活性目的:体外模拟椎间盘炎症微环境,明确TNF-α刺激对髓核细胞的影响,探索炎症微环境中内质网应激活化及其在TNF-α诱导的髓核细胞生物学变化中发挥的作用。方法:体外梯度浓度TNF-α处理大鼠髓核细胞不同时间模拟椎间盘炎症微环境,建立TNF-α诱导的髓核细胞损伤模型。台盼蓝染色检测细胞活力,流式细胞术及Western blot检测细胞凋亡;CCK-8检测细胞增殖活力,流式测细胞周期,qRT-PCR及Western blot检测周期蛋白表达;qRT-PCR检测细胞外基质降解酶类的表达变化。内质网应激特异性阻断剂4PBA阻断内质网应激后,采用qRT-PCR、Western blot、细胞免疫荧光法检测内质网应激的表达活化。流式细胞术及Western blot检测细胞凋亡;CCK-8检测细胞增殖活力,流式测细胞周期,Western blot检测周期蛋白表达;qRT-PCR检测细胞外基质降解酶类的变化。结果:急性TNF-α刺激能降低NPCs活力和增殖能力,引起细胞凋亡增加,并呈浓度依赖性。但随着时间延长,存活的髓核细胞则表现出增殖加快的生物学反应。在TNF-α刺激下,髓核细胞内质网应激及未折叠蛋白反应(UPR)相关指标表达上调。内质网应激抑制剂4PBA能够减弱TNF-α活化的内质网应激,并显著加剧TNF-α诱导的NPCs凋亡、抑制细胞增殖并且增加细胞外基质分解酶表达,加剧细胞外基质降解。结论:急性TNF-α刺激能够诱导内质网应激,内质网应激在TNF-α刺激中主要扮演抗凋亡,促进细胞增殖,减轻细胞外基质降解的保护性角色。第三部分UPR偶联自噬在TNF-α诱导的髓核细胞生物学变化中的作用目的:明确TNF-α刺激下髓核中UPR通路及自噬相关指标的表达和激活,探索自噬与内质网应激相关UPR的偶联关系及其在TNF-α诱导的髓核细胞生物学变化中发挥的作用。方法:在TNF-α刺激髓核细胞的不同时间点,采用qRT-PCR、Western blot、细胞免疫荧光法检测髓核细胞UPR的PERK/eIF2α通路活化情况,以及自噬相关指标LC3B、Beclin-1、ATG5表达情况。构建siRNA分别干扰PERK/eIF2α通路、自噬,采用Western blot、免疫荧光检测siRNA干扰后信号通路活化情况;台盼蓝染色、TUNEL染色评价自噬活化对髓核细胞活力的影响,流式细胞术及Western blot检测其对髓核细胞凋亡的影响;qRT-PCR检测细胞外基质降解酶表达变化。结果:(1)急性TNF-α刺激下髓核细胞PERK/eIF2α通路活化,且自噬指标LC3B、Beclin-1、ATG5表达上调。(2)沉默PERK/eIF2α通路,可以下调自噬指标LC3B、Beclin-1、ATG5表达,说明PERK/eIF2α信号可以介导下游自噬激活。(3)台盼蓝染色、TUNEL染色、流式细胞术及Western blot结果提示干扰PERK/eIF2α通路或干扰自噬信号,都能够明显增加髓核细胞在TNF-α刺激下的细胞凋亡率。(4)沉默自噬信号,可以明显增加TNF-α刺激下的髓核细胞的MMP3、MMP13、ADAMTS4表达。结论:TNF-α在激活髓核细胞UPR反应中PERK/eIF2α通路的同时,也可以激活下游的自噬信号。阻断自噬能够显著增加TNF-α刺激下髓核细胞的凋亡率和细胞外基质降解酶的表达,说明PERK/eIF2α信号通过激活自噬发挥减少髓核细胞凋亡,抑制细胞外基质降解的细胞保护作用。第四部分UPR介导的NF-κB在TNF-α诱导的髓核细胞生物学变化中的作用目的:阐明TNF-α刺激下髓核中UPR通路及NF-κB信号的活化情况及两者的偶联关系,明确它们在TNF-α诱导的髓核细胞生物学变化中发挥的作用。方法:在TNF-α刺激髓核细胞的不同时间点,采用qRT-PCR、Western blot、细胞免疫荧光法检测髓核细胞UPR的IRE1/XBP1通路激活情况,以及NF-κB信号的活化即p65核转移及磷酸化。构建siRNA分别干扰IRE1/XBP1通路、NF-κB-p65。采用免疫荧光、Western blot检测siRNA干扰后信号相关通路活化情况,明确XBP1信号与NF-κB信号的偶联关系。采用CCK-8法检测NPCs增殖活力,Ki67免疫荧光染色检测细胞核增殖抗原Ki67表达水平,流式细胞术检测细胞周期变化,Western blot检测周期蛋白表达变化情况,综合评价NF-κB活化对髓核细胞活力和增殖的影响。结果:(1)急性TNF-α刺激下髓核细胞IRE1/XBP1通路活化,且NF-κB信号指标p65发生磷酸化及细胞核转移。(2)抑制或干扰IRE1/XBP1通路,p65磷酸化和细胞核转位也明显减少,说明IRE1/XBP1通路可以活化下游NF-κB信号。(3)干扰IRE1/XBP1通路或干扰NF-κB信号后,CCK-8、Ki67免疫荧光结果提示NPCs的增殖能力明显减弱;细胞周期提示干扰后的髓核细胞复制期细胞比例明显降低;Western blot检测也提示干扰后细胞周期蛋白表达明显减少。说明XBP1信号及NF-κB信号均可以促进髓核细胞在TNF-α刺激下增殖。结论:TNF-α在激活髓核细胞UPR反应中IRE1/XBP1通路的同时,也可以激活下游NF-κB信号,使得p65磷酸化水平增高及细胞核转移增加。内质网应激通过活化IRE1/XBP1通路介导的NF-κB信号促进髓核细胞在炎症微环境中增殖。