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第一部分核心蛋白聚糖在硬膜外瘢痕组织中的表达目的:探究在腰椎手术后形成的硬膜外瘢痕组织中核心蛋白聚糖的表达水平。方法:以既往行腰椎椎板开窗或椎板切除的患者为研究对象。在患者再次手术时,术中获取硬膜外瘢痕组织和瘢痕组织临近的正常组织。分别提取瘢痕组织和邻近部位正常组织中的总蛋白。然后,通过Western-blot实验检测组织中核心蛋白聚糖、转化生长因子-β1(Transforming growth factor beta 1,TGF-β1)和Ⅰ型胶原的表达水平。此外,通过免疫组织化学染色分析瘢痕组织中核心蛋白聚糖、TGF-β1和Ⅰ型胶原的表达量。结果:Western-blot检测结果显示,与正常组织相比硬膜外瘢痕组织中的核心蛋白聚糖表达水平明显降低。然而,TGF-β1和Ⅰ型胶原在瘢痕组织中的表达显著升高。通过免疫组织化学染色检测显示核心蛋白聚糖阳性表达水平低于正常组织,而TGF-β1和Ⅰ型胶原的阳性表达高于正常组织。结论:核心蛋白聚糖在硬膜外瘢痕组织中的表达明显降低,TGF-β1和Ⅰ型胶原的表达明显升高。核心蛋白聚糖的降低和高浓度的TGF-β1可能共同促进了硬膜外瘢痕的过度增生。第二部分核心蛋白聚糖对人成纤维细胞增殖和转分化的影响及机制研究目的:在体外研究核心蛋白聚糖对人成纤维细胞增殖和转分化的影响,并探索其中可能涉及的分子机制。方法:通过CCK-8细胞增殖和毒性检测试剂盒检测不同浓度的核心蛋白聚糖(1μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL和7.5μg/mL)和TGF-β1(1 ng/mL、2.5 ng/mL、5 ng/mL和10 ng/mL)对体外培养的成纤维细胞增殖的影响。在成纤维细胞经TGF-β1(5 ng/mL)和核心蛋白聚糖(5μg/mL和7.5μg/mL)干预之后,使用Western-blot、Polymerase chain reaction(PCR)和细胞免疫荧光染色检测α-平滑肌肌动蛋白(α-Smooth muscle actin,α-SMA)的表达,以观测核心蛋白聚糖对成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化的影响。同时,通过Western-blot和PCR检测核心蛋白聚糖对TGF-β1刺激之后的成纤维细胞Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和纤连蛋白合成的影响。然后,以细胞免疫荧光染色进一步验证了核心蛋白聚糖对成纤维细胞经TGF-β1刺激之后Ⅰ型胶原和纤连蛋白的表达情况。为了研究核心蛋白聚糖对Smad2/3信号通路的影响,通过Western-blot检测Smad2/3信号通路相关蛋白分子Smad2、p-Smad2、Smad3和p-Smad3的变化。通过细胞免疫荧光染色进一步观察Smad2/3核易位的变化。最后,通过Western-blot检测SIS3(Smad3选择型抑制剂)和核心蛋白聚糖(7.5μg/mL)对经TGF-β1刺激之后的成纤维细胞Smad3、p-Smad3、α-SMA和Ⅰ型胶原的表达。结果:CCK-8实验表明核心蛋白聚糖对成纤维细胞的增殖没有明显影响,而TGF-β1以剂量依耐性的方式促进成纤维细胞增殖。当TGF-β1浓度为5 ng/mL时促进作用达到顶峰。但是,核心蛋白聚糖(5μg/mL和7.5μg/mL)可以明显抑制TGF-β1(5 ng/mL)引起的成纤维细胞增殖。Western-blot和PCR检测结果显示核心蛋白聚糖可以显著抑制TGF-β1刺激之后成纤维细胞α-SMA的表达。细胞免疫荧光结果显示经TGF-β1刺激之后成纤维细胞α-SMA染色明显增强,但是经过核心蛋白聚糖干预之后明显减弱。此外,Western-blot和PCR检测结果显示核心蛋白聚糖可以显著抑制TGF-β1刺激之后成纤维细胞细胞外基质成分(Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和纤连蛋白)的合成。细胞免疫荧光染色显示了同样的趋势。TGF-β1诱导的Smad2/3信号通路的激活具有时间依赖性,使用TGF-β1刺激成纤维细胞1小时后显示Smad2/3信号通路明显激活。然而,Western-blot检测结果显示当使用核心蛋白聚糖(5μg/mL和7.5μg/mL)处理TGF-β1干预过的成纤维细胞后,Smad2和Smad3的磷酸化水平显著降低,而且细胞免疫荧光染色显示核心蛋白聚糖抑制了Smad2/3核易位的过程。此外,Westernblot检测结果显示SIS3(10μM)和核心蛋白聚糖(7.5μg/mL)均可明显抑制TGF-β1刺激之后的成纤维细胞p-Smad3、α-SMA和Ⅰ型胶原的表达。结论:核心蛋白聚糖可以明显抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞增殖和向肌成纤维细胞转分化。此外,核心蛋白聚糖使TGF-β1刺激之后的成纤维细胞胶原纤维和纤连蛋白的生成明显减少。Smad2/3信号通路参与了TGF-β1引起的硬膜外纤维化过程。然而,核心蛋白聚糖可以抑制TGF-β1引起的Smad2/3信号通路激活。第三部分核心蛋白聚糖在预防大鼠椎板切除术后硬膜外纤维化和粘连的体内研究目的:研究核心蛋白聚糖在大鼠椎板切除模型中预防硬膜外纤维化和粘连的效应方法:将128只大鼠随机分为四组:假手术组、模型组、明胶海绵组和核心蛋白聚糖治疗组。假手术组(n=32):接受假手术,不行椎板切除术;模型组(n=32):只行椎板切除术;明胶海绵组(n=32):椎板切除之后在硬脊膜上留置用0.4 mL生理盐水浸润的明胶海绵;核心蛋白聚糖治疗组(n=32):在硬脊膜上留置用0.4 mL核心蛋白聚糖溶液浸润的明胶海绵。在术前和术后分别根据BBB运动功能评分对大鼠后肢运动功能进行评分并记录。在术后4周和8周通过Bruker 7.0 T磁共振成像仪对椎板切除部位进行扫描获取图像。由放射科医生根据磁共振图像对硬膜外瘢痕增生和纤维化的情况进行独立评分。在术后4周和8周,分别从各组随机取8只大鼠沿原切口解剖分离以观察硬膜外纤维化和粘连的情况。然后,根据Rydell标准进行硬膜外粘连的评分。从各组另取8只大鼠。以椎板切除部位为中心,在头尾椎体之间整块切除脊柱,包括周围的肌肉组织和硬膜外纤维化组织。在标本脱钙之后切片,进行H&E染色、Masson染色和免疫组织化学染色。通过H&E染色评估硬膜外成纤维细胞浸润的情况。通过Masson染色评估硬膜外胶原沉积、硬膜厚度和粘连分级。此外,通过免疫组织化学染色分析核心蛋白聚糖在体内对Ⅰ型胶原和纤连蛋白合成的影响。结果:在术前和术后即刻各组大鼠的运动功能评分之间没有明显差异。在4周和8周时,与假手术组相比,模型组和明胶海绵组BBB运动功能评分有所降低。然而,核心蛋白聚糖治疗组BBB运动功能评分没有明显降低,且明显优于模型组和明胶海绵组。大体外观观察显示,在模型组可见硬脊膜外形成了大量瘢痕组织并粘附于硬脊膜上,难以解剖分离。在明胶海绵组,4周时可见硬膜外瘢痕组织与硬脊膜轻度粘连,容易剥离。但在8周时,硬膜外瘢痕组织与硬脊膜形成紧密粘连,难以解剖分离。相比之下,在核心蛋白聚糖治疗组只显示出较轻的硬膜外粘连,可通过钝性牵拉将硬膜外瘢痕和硬脊膜直接分离。基于Rydell标准的硬膜外粘连评分结果显示,核心蛋白聚糖治疗组在在4周和8周时均显示最低的硬膜外粘连评分,表示相比于其他组硬膜外粘连最轻。磁共振扫描结果显示,在模型组中大鼠硬膜外瘢痕增生致使硬膜囊受压。在明胶海绵组中,4周时可以观察到致密的瘢痕组织形成,但是没有对硬脊膜造成明显的压迫。然而,8周时硬膜周围可见致密的瘢痕组织明显增加,对硬膜囊造成压迫。核心蛋白聚糖治疗组在4周和8周时硬膜囊周围仅有少量致密瘢痕组织形成,硬膜囊没有显示受压凹陷。基于磁共振图像的硬膜外瘢痕增生和纤维化的评估分级显示,核心蛋白聚糖治疗组所获评级最低,代表硬膜外瘢痕增生和纤维化的程度最低。H&E染色和Masson染色结果显示,模型组中硬膜外充满丰富的瘢痕组织,硬膜外粘连广泛且严重。在明胶海绵组中,虽然硬脊膜和硬膜外瘢痕组织之间存在模糊的间隙,但在8周时被许多纤维连接填充。相比之下,在核心蛋白聚糖治疗组的组织切片上显示的间隙在第4周和第8周时更为明显。此外,模型组和明胶海绵组比核心蛋白聚糖治疗组显示出更多的成纤维细胞浸润。核心蛋白聚糖治疗组和模型组相比以及核心蛋白聚糖治疗组和明胶海绵组相比均存在显著差异。这表明核心蛋白聚糖可以抑制体内成纤维细胞的增殖。此外,在4周和8周时,模型组和明胶海绵组的硬脑膜平均厚度值明显高于假手术组。但模型组与明胶海绵组之间没有显著差异。然而,在4周和8周时核心蛋白聚糖治疗组与模型组和明胶海绵组相比均存在显著差异。在核心蛋白聚糖治疗组中观察到最低的硬膜外纤维化病理评分,表明该组中的硬膜外纤维化和硬膜外粘连显著减少。免疫组织化学染色结果显示核心蛋白聚糖在体内抑制了Ⅰ型胶原蛋白和纤连蛋白的合成。结论:椎板切除术后硬膜外纤维化和粘连可能造成神经功能的损害。核心蛋白聚糖在体内可以减少成纤维细胞浸润,抑制细胞外基质的合成,从而达到预防硬膜外纤维化和粘连的作用。