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乳腺肿瘤是犬类最常见的肿瘤之一,约50%为恶性,且发病率和死亡率居高不下,对犬的生命健康造成了严重的威胁。近年,有研究学者确证了肿瘤内含有微生物菌群,并提出局部菌群可能直接促进DNA损伤和增加诱变,激活致癌信号通路,以及通过与宿主免疫系统的相互作用影响肿瘤进程,肿瘤的发生发展与菌群相关,但其确切作用机制尚不完全清楚。目前,这些菌群与疾病之间的相关性成为当前研究的前沿热点问题。而在兽医临床上,关于动物肿瘤菌群的研究处于一片空白。作为犬常发的肿瘤类型,犬乳腺肿瘤内是否存在菌群,迄今为止还未见报道。本研究基于“肿瘤组织内存在特异菌群”,犬乳腺肿瘤瘤内菌群与消化道菌群具有关联性,且影响肿瘤发展这一理论假设,展开以下研究:1)流行病学分析:收集整理2017年到2021年国内不同地区多家动物医院记录的肿瘤患犬信息,包括年龄、性别、品种、体型、是否绝育、生活地区、既往病史、肿瘤部位、肿瘤数量、肿瘤大小、肿瘤病理学性质。统计结果表明,犬类肿瘤的前三种类型是乳腺肿瘤、皮肤肿瘤和肛周肿瘤。犬乳腺肿瘤常发于9-12岁未绝育的母犬,良性和恶性肿瘤占比分别为48.41%和51.59%。通常,单发性肿瘤的比例可达55.36%,犬的最后两对乳腺较为常发。结果表明犬乳腺肿瘤是常见高发的肿瘤类型,开展该病的预防和诊治具有应用前景和较大经济价值。2)对乳腺肿瘤患犬进行鉴定:收集患犬的乳腺肿物组织、血液等样本,通过表观检查、血液学、影像学、组织病理学、血清ELISA和分子生物学检查。结果显示,表观检查可见患犬的乳腺部位有明显肿块,质地坚实,甚至破溃;血液学检查提示患犬体内有炎症反应;影像学检查提示乳腺部位肿物凸起,质地不均,血供丰富;组织病理学确定了恶性肿瘤有68例,良性56例;q PCR结果显示犬乳腺肿瘤组织中的肿瘤标志物HER-2、CA15-3、CEA、SF、Vimentin、N-cadherin的相对表达量显著高于对照组织,而E-cadherin明显降低（P＜0.05）。除此之外,肿瘤标志物ER、PR在两组间无显著性差异,ELISA结果与之一致。这些结合临床和实验室的结果确定了乳腺肿瘤患犬的诊断,用于后续的研究。3)分析乳腺肿瘤患犬的瘤内菌群特征:对患犬的乳腺肿瘤组织和瘤旁乳腺组织样本进行了16S r RNA等微生物学高通量测序。结果显示,犬乳腺肿瘤组织内并非是无菌环境,存在特异的微生物菌群。在门水平上占主导地位的菌群有Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidota;在属水平上的优势物种为Ralstonia、Allorhizobium、Pseudomonas、Bacteroides、Lactobacillus、Methylorubrum和Acetobacter等。4)分析乳腺肿瘤患犬的肠道菌群特征:对乳腺肿瘤患犬和健康犬的粪便样本进行16S r RNA高通量测序。结果显示,乳腺肿瘤患犬与健康犬的粪便样本中均存在特异的微生物群落,且两者相比,肠道菌群分布及丰富度存在一定的差异;在属水平上,乳腺肿瘤患犬的肠道优势菌群有Ralstonia、Allorhizobium、Pseudomonas、Bacteroides、Lactobacillus、Methylorubrum和Acetobacter等,其中,乳腺肿瘤患犬的肠道菌群中Bacteroides、Helicobacter和Cetobacterium的丰度显著升高,提示这些肠道差异菌群可能在犬乳腺肿瘤的发生发展中发挥着重要作用。5)分析乳腺肿瘤患犬的口腔菌群特征:对乳腺肿瘤患犬和健康犬的口腔拭子样本进行16S r RNA高通量测序。结果显示,乳腺肿瘤患犬与健康犬的口腔拭子样本中均存在特异的微生物群落,且两者相比,口腔菌群分布及丰富度存在一定的差异;在属水平上,乳腺肿瘤患犬的口腔优势菌群有Porphyromonas、Fusobacterium、Moraxella、Haemophilus、Corynebacterium、Streptococcus等;与健康犬相比,乳腺肿瘤患犬的口腔菌群中Treponema、Bacteroide、Acholeplasma、Pseudomonas、Mycoplasma的相对丰度显著升高,Fusobacterium与之相反,提示这些口腔差异菌群可能在犬乳腺肿瘤的发生发展中发挥着重要作用。6)犬乳腺肿瘤、肠道、口腔菌群之间的关联性分析:采用培养组学法对肿瘤内菌群进行分离后,接种到三种犬乳腺肿瘤细胞系CHMp、CHMm、IMC-118后进行胞内菌落计数、激光共聚焦扫描细菌入侵情况,使用CCK-8试剂初步确定瘤内细菌对肿瘤细胞的影响。结果显示,三者之间存在共同菌群,即Streptococcus、Staphylococcus、Corynebacterium和Bacteroides;且在犬乳腺肿瘤组织中成功分离出5种细菌,经革兰氏染色、电镜扫描以及16S r RNA等鉴定后确定分别为Cutibacterium acnes、Streptococcus anginosus、Staphylococcus simulans、Staphylococcus epidermidis和Corynebacterium canis;菌落计数法显示上清液涂板未长出单菌落,细胞裂解液中有细菌生长,则说明各个细菌成功入侵到犬乳腺肿瘤细胞中;激光共聚焦更直观地观察细菌入侵到犬乳腺肿瘤细胞;CCK-8检测结果,细胞存活率随着细菌的浓度呈正比。综上所述,流行病学调查证实了犬乳腺肿瘤是小动物临床上多发的肿瘤类型,通过16S r RNA高通量测序分析,确定了犬乳腺肿瘤组织内存在特异性菌群,且确证犬乳腺肿瘤组织、肠道、口腔菌群具有共同菌群,体外验证瘤内细菌对肿瘤细胞增殖具有促进作用。本研究初步揭示了菌群与犬乳腺肿瘤的发生发展具有相关性,为后续研究菌群在犬乳腺肿瘤发生发展中的作用及作用机制奠定良好的基础。