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哺乳动物在胚胎发育和配子发生过程中经历了甲基化谱式的重编程。基因组首先发生了去甲基化,然后新的甲基化谱式在起始性甲基转移酶的作用下建立起来。甲基化谱式的准确建立需要对起始性甲基转移酶的活性行精细的控制。Dnmt3L是目前已知的唯一的起始性甲基转移酶的正调控因子,而且对起始性甲基化活性的靶向性具有重要的影响。因而,Dnmt3L的调控机制是十分值得研究的问题。
本文研究了小鼠胚胎早期发育过程中起始性甲基转移酶Dnmt3a、Dnmt3b以及Dnmt3L的表达谱式,发现Dnmt3L与Oct4等基因一样在早期发育过程中受到了严格的调控。甲基化分析表明,当Dnmt3L在上胚层中被下调时,Dnmt3L的启动子发生了起始性甲基化。我们在ES细胞体外分化系统和小鼠胚胎中分析了各个Dnmt3因子对Dnmt3L启动子甲基化和Dnmt3L转录抑制的影响。通过比较不同Dnmt3缺失时Dnmt3L启动子甲基化和转录水平的变化,我们发现Dnmt3a、Dnmt3b和Dnmt3L都参与Dnmt3L的启动子甲基化和转录抑制,其中Dnmt3b是主要的甲基转移酶,而Dnmt3a和Dnmt3L则可能主要作为转录抑制或酶活调控的辅因子起作用。通过染色质免疫共沉淀实验,我们发现在ES细胞分化时,Dnmt3b被招募到了Dnmt3L的启动子上。在这些发现的基础上,我们提出了一个起始性甲基化活性的自调控模型,即起始性甲基化活性可以反馈调控其调控因子Dnmt3L,从而实现自调控。与实验结果相一致是,我们发现在ICF综合症的小鼠模型,Dnmt3L的启动子处于严重低甲基化状态。这一现象在ICF病人样品中也存在,虽然没有那么严重。因此,启动子甲基化不足引起的DNMT3L表达水平的上调可能影响了ICF综合症的表型形成。为了研究DNMT3L过表达对发育的影响,我们制作了Dnmt3L的转基因小鼠,并进行了初步的表型分析。分析结果提示我们,Dnmt3L的过表达可能会导致早衰、癌症和配子发生障碍。这一研究仍在进行中。本文同时以小鼠的精子发生为模型,探讨了干细胞分化过程中基因组甲基化谱式的变化情况。我们分离纯化了各个发育阶段的雄性生殖细胞,并分析了其基因组的甲基化水平。结果显示,在精原细胞向成熟精子发育过程中,基因组也发生了一定程度的甲基化谱式重编程。进而研究了精子发生过程中起始性甲基转移酶的表达情况,对这一甲基化调控的机制做了初步探讨。