肿瘤细胞可以通过免疫逃逸机制躲避免疫细胞的监视,而免疫检查点抑制剂（Immune checkpoint inhibitors,ICIs）能部分恢复免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。ICIs临床应用的关键在于通过特异性标志物筛选出治疗有效的优势人群,但目前免疫标志物的准确性不能满足临床需求。染色质组装因子1亚基A（Chromatin assembly factor 1 subunit A,CHAF1A）是染色质装配因子-1（Chromatin assembly factor 1,CAF-1）的重要亚基之一,参与调控染色体的螺旋化和解螺旋,以及参与DNA损伤修复（DNA damage repair,DDR）过程。由于DDR相关基因与免疫治疗疗效有密切关系,本研究提出CHAF1A影响ICIs疗效的科学假说,通过多组学数据和实验等加以验证,并初步探索了相关机制。本研究首次发现CHAF1A m RNA表达量与现有免疫标志物、肿瘤微环境（Tumor microenvironment,TME）中免疫细胞浸润以及ICIs疗效密切相关,其机制与CHAF1A抑制转化生长因子-β（Transforming growth factor-β,TGF-β）信号通路有关。本课题初步证实CHAF1A可以作为ICIs疗效评价的候选标志物,有利于优化免疫治疗策略。第一部分CHAF1A m RNA表达与常见免疫标志物的关系研究背景:目前实体瘤的免疫标志物主要包括程序性死亡配体-1（Programmed death ligand-1,PD-L1）表达、肿瘤突变负荷（Tumor mutation burden,TMB）、肿瘤新抗原负荷（Tumor neoantigen load,TNB）、微卫星不稳定性（Microsatellite instability,MSI）、错配修复缺陷（Mismatch repair deficiency,d MMR）等。前期研究发现CHAF1A是CAF-1主要功能亚基之一,在DDR中起重要作用。DDR通路是机体维持基因组遗传稳定的重要机制。因此,DDR缺陷将导致基因突变不断累积。这与较高的TMB、TNB和MSI有关,但是CHAF1A与肿瘤免疫标志物的关系尚未明确。目的:探究CHAF1A m RNA表达量与实体瘤常见免疫相关特征的关系,评估CHAF1A成为肿瘤免疫治疗标志物的潜力。方法:1)泛癌分析CHAF1A m RNA在癌与癌旁的表达差异:针对癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）泛癌队列中22种实体肿瘤进行肿瘤组织与正常组织的CHAF1A m RNA表达差异分析。2)泛癌分析CHAF1A m RNA表达量与免疫标志物及免疫分型的相关性:在从TCGA队列中筛选出的MSI＞5%的癌种中,通过Student’s t检验比较CHAF1A在MSI和微卫星稳定（Microsatellite stable,MSS）组中m RNA表达量的差异。通过Spearman分析探究CHAF1A m RNA表达量与TMB、TNB的相关性。通过组间差异分析比较不同免疫分型中CHAF1A m RNA的表达量。3)在胃癌队列中验证CHAF1A m RNA表达量与免疫标志物的相关性:使用经高通量测序的34例本地胃癌样本构建的江苏大学附属医院（Affiliated Hospital of Jiangsu University,AHJU）胃癌队列数据,以及从公共数据库亚洲癌症研究小组（Asian Cancer Research Group,ACRG）中下载的胃癌m RNA表达和突变数据,验证泛癌种的分析结果,并分析CHAF1A m RNA与免疫基因表达的关系。结果:1)CHAF1A与常见免疫相关基因组特征有关:在TCGA泛癌队列中,有19种实体肿瘤的CHAF1A m RNA表达量显著高于癌旁（p＜0.05）。在MSI＞5%的3个癌种中,MSI组CHAF1A m RNA表达相比MSS组显著升高。CHAF1A m RNA表达量与大多数癌种（n=16）的TMB、TNB呈显著正相关（p＜0.05）。这些结果在ACRG和AHJU胃癌队列中得到进一步验证。2)CHAF1A与免疫分型及免疫基因表达有关:TCGA泛癌队列根据免疫浸润特征分型,干扰素-γ（Interferon-γ,IFN-γ）优势型的CHAF1A m RNA显著高于其它免疫亚型（p＜0.001）。在免疫检查点相关基因集以及T细胞效应/IFN-γ基因集中,CHAF1A与包括PD-L1在内的多数基因的m RNA表达量呈显著正相关（p＜0.05）。结论:CHAF1A与现有免疫标志物密切相关并在免疫浸润优势型中高表达。第二部分CHAF1A m RNA表达与免疫浸润的关系研究背景:TME中免疫细胞浸润与ICIs疗效有关,例如CD8+T细胞浸润活跃的“热肿瘤”有较高的ICIs治疗有效率。目前免疫浸润的分析方法主要有基于基因表达的生信算法和基于多重免疫荧光染色（Multi-color immunofluorescence,m IF）等实验的计数等。目的:探究CHAF1A m RNA表达与免疫浸润的关系,揭示CHAF1A在TME中的作用。方法:1)泛癌分析CHAF1A m RNA表达与免疫细胞浸润的关系:针对AHJU、ACRG和TCGA队列中的转录组数据,运用x Cell免疫浸润算法计算每种免疫细胞浸润的富集分数。Spearman相关性分析CHAF1A m RNA表达量与各癌种中免疫细胞浸润富集分数的相关性。2)在胃癌标本中验证CHAF1A m RNA表达与免疫细胞浸润的关系:通过对8例有转录组数据的AHJU胃癌组织样本进行m IF,分析CHAF1A m RNA表达量与免疫细胞浸润数量和有效浸润度（Effective infiltration degree,EID）的关系。公式:EID=肿瘤实质中免疫细胞数量/（肿瘤实质+间质中总的免疫细胞数量）。结果:1)CHAF1A与浸润性免疫细胞的富集分数有关:通过对TCGA泛癌队列分析,CHAF1A m RNA表达量与所有癌种中的辅助性T细胞1（Helper T cells 1,Th1）浸润富集分数呈显著正相关（p＜0.05）,与大多数癌种中的成纤维细胞、M2型巨噬细胞以及调节性T细胞浸润富集分数呈显著负相关（p＜0.05）。在AHJU和ACRG胃癌验证队列中,CHAF1A m RNA表达量与Th1细胞、M1型巨噬细胞浸润富集分数呈显著正相关,与成纤维细胞浸润富集分数呈显著负相关（p＜0.05）。2)CHAF1A与免疫细胞浸润数量及其浸润能力有关:对AHJU胃癌样本的m IF发现,CHAF1A m RNA表达量与肿瘤实质中的M1型巨噬细胞、自然杀伤细胞（Natural killer cells,NKs）的数量呈高度正相关（Spearman r=0.69和0.62）,但统计学显著性受限于样本量（p＞0.05）。此外,CHAF1A m RNA表达量与NKs和CD56 bright细胞的EID呈正相关（Spearman r=0.52和0.64）,与M2型巨噬细胞的EID呈显著负相关（Spearman r=-0.81,p＜0.05）。结论:CHAF1A m RNA高表达与免疫细胞浸润密切相关,可作为TME中免疫活化的标记。第三部分CHAF1A m RNA表达与ICIs疗效的关系研究背景:现有免疫标志物仍存在一定局限性,例如PD-L1检测抗体各异、TMB计算方法不统一及MSI存在假阳性或假阴性等,亟需寻找其它标志物。本课题在第一和第二部分的研究发现,CHAF1A m RNA表达量与现有多种免疫标志物以及免疫细胞浸润密切相关,提示可能与ICIs疗效也有关系。目的:研究CHAF1A m RNA表达量与ICIs治疗敏感性的关系,为免疫治疗提供新的疗效评价标志物。方法:1)临床免疫治疗队列探索CHAF1A m RNA表达量与ICIs疗效的关系:通过ROC曲线下面积（Area under curve,AUC）的最佳截断值即约登指数（Youden index）作为CHAF1A m RNA表达的分界值,将队列分成高低表达两组。针对IMvigor210晚期尿路上皮癌免疫治疗队列（NCT#02108652）和韩国转移性胃癌免疫治疗队列（NCT#02589496）,通过Student’s t检验比较ICIs治疗有效与无效组的CHAF1A m RNA表达量,以及通过费舍尔精确检验（Fisher’s exact tests）比较CHAF1A m RNA高表达组和低表达组的客观缓解率（Objective response rate,ORR）。运用Kaplan-Meier生存分析联合Log-rank检验探究CHAF1A m RNA表达量对总生存期（Overall survival,OS）的影响,并且计算风险比（Hazard ratio,HR）和置信区间（Confidence interval,CI）。基于m RNA表达数据,通过ESTIMATE算法估计TME中基质细胞和免疫细胞的浸润程度,Stromal Score、Immune Score和ESTIMATEScore分别代表基质细胞浸润程度评分、免疫细胞浸润程度评分以及两者之和。2)动物实验验证CHAF1A对ICIs治疗敏感性的关系:构建CHAF1A稳定沉默的B16F10小鼠黑色素瘤细胞。对免疫功能正常的C57bl/6荷瘤小鼠每3天尾静脉注射ICIs以及阴性对照抗体Ig G。通过计算相对肿瘤增殖率（T/C）评估CHAF1A对ICIs治疗敏感性的影响。结果:1)CHAF1A m RNA低表达与ICIs治疗抵抗有关:在晚期尿路上皮癌和转移性胃癌队列中,ICIs治疗有效组的CHAF1A m RNA表达量均显著高于治疗无效组（p＜0.05）,并且CHAF1A m RNA高表达组的ORR显著高于低表达组（尿路上皮癌:49%vs.17.4%;胃癌:47.4%vs.11.5%;均p＜0.05）。更重要的是,CHAF1A m RNA表达量对晚期尿路上皮癌ICIs疗效的预测优于Stromal Score、Immune Score和ESTIMATEScore,AUC分别为0.642、0.603、0.512以及0.592。CHAF1A m RNA高表达晚期尿路上皮癌患者的中位OS大于21个月,而低表达患者的中位OS仅为8个月（HR=0.18,95%CI:0.09-0.27,p＜0.001）。此外,在胃癌免疫治疗队列中,CHAF1A m RNA表达对ICIs有效性的预测优于MSI以及EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）,AUC分别为0.724、0.693以及0.708。CHAF1A m RNA表达联合MSI以及CHAF1A m RNA表达联合EBV的AUC分别为0.792和0.902。2)CHAF1A低表达降低肿瘤对ICIs治疗的敏感性:通过对肿瘤瘤体生长曲线以及T/C进行分析发现,ICIs免疫治疗组的瘤体较对照组缩小,并且敲减CHAF1A也缩小瘤体,但是敲减CHAF1A联合ICIs组的T/C较单用ICIs组增加（治疗后第13天的T/C为45%比34%,p＜0.05）。结论:相比于现有的免疫标志物,CHAF1A m RNA表达量对ICIs疗效预测更准确;CHAF1A低表达会降低肿瘤对ICIs治疗的敏感性。第四部分CHAF1A影响ICIs疗效的初步机制研究研究背景:肿瘤免疫生物学是多种免疫抑制和免疫刺激成分相互作用的复杂过程,涉及一系列基因的表达调控。CHAF1A参与染色质组装,在基因表达调控中有着非常重要的作用。通过对CHAF1A高低表达组间的差异表达基因（Differentially expressed genes,DEGs）分析及功能注释,有望定位到影响ICIs疗效的免疫相关通路,如TGF-β相关信号通路等。研究发现,TGF-β相关信号通路的活化抑制免疫浸润,是ICIs耐药的重要原因。目的:通过DEGs分析及基因集富集分析（Gene set enrichment analysis,GSEA）寻找CHAF1A影响ICIs疗效的相关信号通路,并通过细胞实验验证,进一步揭示CHAF1A对TME的调节机制。方法:1)寻找与CHAF1A密切相关的下游通路:通过GSEA对ACRG队列中CHAF1A高表达组与低表达组的DEGs行京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）信号通路和基因本体论（Gene ontology,GO）分析,探究CHAF1A参与调节TME的信号通路。2)在胃癌细胞中验证CHAF1A m RNA表达量与下游通路关系:选取胃癌细胞系AGS和HGC-27,用小干扰敲减CHAF1A后,通过反转录酶-聚合酶链锁反应及免疫印迹实验验证CHAF1A与TGF-β信号通路的关系。并且通过在稳定沉默CHAF1A的细胞系中加入TGF-β受体（TGF-βreceptor,TGFβR）抑制剂,验证CHAF1A调节下游TGF-β相关信号通路。结果:1)在胃癌中CHAF1A与TGF-β通路密切相关:在CHAF1A高表达组显著富集（富集分数Enrichment Score为正）的DEGs主要与免疫反应相关的信号或基因功能有关,同时,与DNA修复、细胞周期及能量代谢等有关的DEGs也在CHAF1A高表达组显著富集,提示CHAF1A高表达的癌细胞可能增殖活跃。在CHAF1A低表达组显著富集的DEGs（富集分数Enrichment Score为负）主要与一系列的肿瘤恶性行为相关通路或功能有关,尤其是其中包括TGF-βR信号通路,提示CHAF1A高表达可能抑制TGF-β信号。2)CHAF1A调控胃癌细胞系中TGF-β的表达:敲减CHAF1A显著上调胃癌细胞AGS和HGC-27的转化生长因子-β1（Transforming growth factor-β,TGF-β1）m RNA和蛋白表达（p＜0.05）,并显著上调TGF-β1通路下游p Smad3的蛋白表达（p＜0.05）。上述结果可被TGF-βR抑制剂逆转。结论:TGF-β1/p Smad3是CHAF1A的下游调控通路,CHAF1A可能通过抑制该通路提高肿瘤对ICIs的敏感性。