党参(Codonopsis radix)作为补益类药物,具有健脾补肺、益气生津的功效,是常用的治疗及保健中药材;其生长周期长,需经3-4年生长后才可采挖;药食两用,市场需求量大、临床应用广泛。而党参地上部分的茎、叶中被证明含有多糖、萜类、甾醇类、皂苷类、氨基酸、微量元素等成分,常常被弃置不用。因此,从药用上、经济上和资源扩大利用上均显示将党参地上部分制作成饲料添加剂具有很大的开发前景和价值潜力。但直到目前,国内外对其的研究很有限。因此对党参地上部分进行深入研究,对其进一步开发利用具有巨大的现实意义和潜在的经济价值。重庆巫山庙宇党参属于川党参,本课题组前期对巫山庙宇党参(Codonopsis tangshen Oliv.)研究表明,庙宇党参相比其他产地的党参,总氨基酸,味觉氨基酸丰富,党参多糖含量高,笃坪川党参和红椿川党参在不同的产地中其脂溶性成分的含量都偏高,营养价值突出。其次,课题组对党参芦头、根、茎、叶成分比较分析发现茎与根部化学成分类别差异并不大,但在成分含量上有差异,进一步提供了川党参地上部分具有开发利用价值的数据支撑。本文以巫山庙宇川党参地上部分为主要研究对象,通过对党参炔苷、党参多糖、总皂苷、水解氨基酸和微量元素等成分,重点研究川党参地上部分作为饲料添加剂可能的物质基础;通过将川党参地上部分细粉添加到乌皮红冠土鸡的日粮饲料中,研究其对乌皮红冠土鸡的生长性能、免疫性能和肠道菌群的影响,为进一步开发、利用川党参地上部分在养殖畜牧业生产实践中的应用、开发新型绿色饲料添加剂提供实验依据。方法1川党参地上部分作为饲料添加剂的物质基础研究采用高效液相色谱法对不同批次的川党参地上部分建立特征图谱,与川党参进行相似度比较,并测定党参炔苷含量;通过化学分析方法对川党参地上部分和川党参的总多糖、总皂苷、水解氨基酸和微量元素进行含量测定。2川党参地上部分作为饲料添加剂的功效评价川党参地上部分细粉制作:秋季(白露节前后川党参已采收)采集不同产地的川党参地上部分,按照2015版药典要求,切段,55℃干燥,粉碎,过筛(4号)。按照1%、3%、5%的不同比例添加到乌皮红冠土鸡饲料日粮里,混合均匀,进行为期49天的饲养,研究其对乌皮红冠土鸡的生长性能、免疫性能和肠道菌群的影响。2.1川党参地上部分对乌皮红冠土鸡生长性能的影响通过定期称重、屠宰后屠宰率、胸肌率、料重比等考查党参地上部分对乌皮红冠土鸡生长性能的影响。2.2川党参地上部分对乌皮红冠土鸡免疫性能的影响通过定期屠宰后测定乌皮红冠土鸡免疫器官指数、21日和49日测定免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA)、白细胞介素(IL-1、IL-2、IL-6)的含量来探讨和评价川党参地上部分对红冠土鸡免疫性能的影响。2.3党参地上部分对乌皮红冠土鸡肠道菌群的影响49日喂养后,采集红冠土鸡粪便样本,通过16SrDNA扩增子测序(16Sr DNA Amplicon Sequencing),利用保守区设计通用引物进行PCR扩增,然后对高变区进行测序分析,进而研究粪便样品中微生物菌群的多样性。结果1川党参地上部分作为饲料添加剂的物质基础研究不同产地川党参地上部分HPLC特征图谱中,均有6个特征峰,各峰相对保留时间RSD%<1%。16批川党参地上部分HPLC图谱与13批川党参HPLC特征图谱相似度在0.197~0.845之间。川党参地上部分党参炔苷平均含量为0.566mg/g,约为川党参的39%。川党参地上部分党参总多糖的含量为3.234±0.171%,约为川党参的10%。川党参地上部分总皂苷的含量分别为13.584±0.717mg/g,约为川党参的29%。川党参地上部分和川党参均含有17种水解氨基酸,7种必需氨基酸;川党参地上部分水解氨基酸的含量是根含量的2.06倍;川党参地上部分必需氨基酸的含量是根含量的2.84倍。川党参地上部分和川党参均含有13种微量元素,除铁、硼、钼、砷外,其余9种川党参地上部分微量元素的含量均超过了川党参。川党参地上部分微量元素含量前五位的分别是铁(212.830±3.783 mg/kg)、硅(214.555±6.324 mg/kg)、铝(116.864±6.276 mg/kg)、硒(180.800±10.536 mg/kg)、锰(120.440±0.336 mg/kg)。2川党参地上部分作为饲料添加剂的功效评价2.1川党参地上部分促进乌皮红冠土鸡的生长性能42d增重研究结果显示,与空白组比较,低剂量组增加3.59%,中剂量组增加1.31%,高剂量组降低3.37%。平均日增重结果显示,与空白组比较,低剂量组增加3.80%,中剂量组增加1.35%,高剂量组降低3.50%。料重比研究结果显示,与空白组比较,低剂量组降低5.63%,中剂量组降低8.66%,高剂量组降低12.99%。结果显示,低剂量组效果最好。III 2.2川党参地上部分调节乌皮红冠土鸡的免疫功能49d免疫器官指数结果显示,与空白组相比,低剂量组胸腺指数、脾脏指数、法氏囊指数分别增加23.97%、21.51%、15.32%;中剂量组胸腺指数、脾脏指数、法氏囊指数分别增加57.23%、19.77%、14.52%;高剂量组胸腺指数、脾脏指数、法氏囊指数分别增加33.06%、59.88%、17.74%。49d免疫球蛋白研究结果显示,与空白组比较,低剂量组IgG、IgM、IgA含量分别增加2.56%、28.33%、13.63%;中剂量组IgG、IgM、IgA含量分别增加20.70%、46.02%、26.52%;高剂量组IgG、IgM、IgA含量分别增加36.22%、65.61%、45.16%。49d白细胞介素-1(IL-1)研究结果显示,与空白组相比,低剂量组、中剂量组和高剂量组分别降低18.08%、27.19%、52.80%;49d白细胞介素-2(IL-2)研究结果显示,与空白组相比,低剂量组、中剂量组和高剂量组分别增加24.71%、82.28%、106.79%;49d白细胞介素-6(IL-6)研究结果显示,与空白组相比,低剂量组、中剂量组和高剂量组分别增加106.05%、195.35%、237.67%。2.3川党参地上部分改善乌皮红冠土鸡肠道菌群肠道菌群物种注释结果显示,在门水平上占据主导地位的主要包括Firmicutes、Bacteroidetes、Actinobacteria;在纲水平上主导的为Bacilli、Bacteroidia、Clostridia;在目水平上的优势物种为Lactobacillales、Bacteroidales、Clostridiales;在科水平上的优势物种为Lactobacillaceae、Bacteroidaceae、Veillonellaceae;在属水平上的优势物种为Lactobacillus、Bacteroides、Megamonas;优势种为Lactobacillus_aviarius、Lactobacillus_gasseri、Bacteroides_salanitronis。基于OTU的Venn图和花瓣图研究结果显示,在OTU个数上,与空白组比较,低剂量组、中剂量组和高剂量组OUT个数分别增加38.21%、25.13%、31.55%。科水平上的物种丰度分析结果显示,与空白组相比,低剂量组、中剂量组和高剂量组Lactobacillaceae(乳杆菌科)相对丰度分别升高了49.96倍、22.54倍、18.39倍;α多样性分析:Alpha Diversity指数研究结果显示,与空白组相比,低剂量组observed_species、Chao1、ACE、PD_whole_tree分别增加36.45%、39.58%、43.71%、55.48%;中剂量组observed_species、Chao1、ACE、PD_whole_tree分别增加16.52%、18.45%、22.26%、24.12%;高剂量组observed_species、Chao1、ACE、PD_whole_tree分别增加13.90%、42.51%、23.51%、25.14%;物种多样性曲线稀释曲线和等级聚类曲线结果均显示各分组样本中物种的丰富程度从大到小依次为低剂量组、中剂量组、高剂量组和空白组,其中低剂量组物种丰度最好。UPGMA聚类树研究结果显示,低剂量组、中剂量组、高剂量组与空白组比较,聚类物种更丰富。β多样性分析研究结果显示,低剂量组、中剂量组、高剂量与空白组相比均具有显著性差异。组间差异分析结果显示,低剂量组、中剂量组、高剂量组和空白组比较,均具有显著性差异(P<0.01)。组间差异物种分析:T-test研究结果显示,低剂量组与空白组间差异显著(p<0.01)。差异物种主要为Firmicutes、Bacteroidetes、Proteobacteria、Synergistetes。Meta Stat研究结果显示,各分组中变形菌门(Proteobacteria)、Melainabacteria差异显著(q value<0.05);厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、互养菌门(Synergistetes)具有极显著性差异(P<0.01)。Simper研究结果显示,科水平上低剂量组、中剂量组、高剂量组与空白组相比,差异贡献度由大到小均为Lactobacillaceae(乳杆菌科)、Bacteroidaceae(拟杆菌科)、Veillonellaceae(韦荣氏球菌科)、Rikenellaceae(理研菌科)、Ruminococcaceae(瘤胃菌科)、Lachnospiraceae(毛螺菌科)、Dermabacteraceae(皮杆菌科)、Acidobacteriaceae(酸杆菌科)、Enterobacteriaceae(肠杆菌科)和Enterococcaceae(肠球菌科)。结论川党参地上部分物质基础研究显示川党参地上部分含有与川党参类似的物质成分,川党参地上部分党参炔苷、党参总多糖、党参总皂苷的含量分别约为川党参的39%、10%、29%。川党参地上部分的水解氨基酸、人体必需氨基酸的含量分别约为川党参的2.06倍、2.84倍。川党参地上部分促进乌皮红冠土鸡的生长,低剂量组乌皮红冠土鸡的体重比空白组增加3.59%。川党参地上部分增强乌皮红冠土鸡的免疫功能,胸腺指数低、中、高剂量组分别比空白组增加23.97%、57.23%、33.06%;脾脏指数低、中、高剂量组分别比空白组增加21.51%、19.77%、59.88%;法氏囊指数低、中、高剂量组分别比空白组增加15.32%、14.52%、17.74%。IgG含量低、中、高剂量组分别比空白组增加2.56%、20.70%、36.22%;IgM含量低、中、高剂量组分别比空白组增加28.33%、46.02%、65.61%;IgA含量低、中、高剂量组分别比空白组增加13.63%、26.52%、45.16%。白细胞介素-1(IL-1)低、中、高剂量组分别比空白组降低18.08%、27.19%、52.80%;白细胞介素-2(IL-2)低、中、高剂量组比空白组分别增加24.71%、82.28%、106.79%;白细胞介素-6(IL-6)低、中、高剂量组分别比空白组增加106.05%、195.35%、237.67%。川党参地上部分增加乌皮红冠土鸡肠道菌群的物种丰度和多样性,促进肠道有益菌群(乳杆菌)的生长。低、中、高剂量组OUT个数分别比空白组增加38.21%、25.13%、31.55%。低剂量组、中剂量组和高剂量组科水平上Lactobacillaceae(乳杆菌科)的物种丰度分别是空白组相对丰度的49.96倍、22.54倍、18.39倍。实验结果显示,低剂量组效果最好。川党参地上部分作为饲料添加剂具有良好的开发前景。