目的:本课题旨在研究“智三针”改善宫内窘迫缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)模型大鼠认知行为障碍的内在机制。探讨智三针对HIBD大鼠脑部海马区受损神经元病理变化的影响;从NLRP3炎症体活化机制切入,阐明智三针通过调控HIBD大鼠神经元自噬流的强度从而抑制NLRP3炎症体活化,改善神经元损伤的作用通路,为针刺治疗围产期缺氧缺血性脑病的机制研究提供理论依据。方法:采用延迟10分钟剖宫产方法复制宫内窘迫HIBD新生大鼠模型。在新生大鼠出生后第15天给予针刺干预(“智三针”包括神庭穴、双侧本神穴),每天干预1次,每次留针10分钟,连续14天。本研究共分为四部分:(1)第一部分实验评价针刺对HIBD大鼠生长发育状况的影响,包括体重测定和mNSS神经功能缺损评分;(2)第二部分实验应用旷场试验、新物体识别实验和物体位置识别实验评价针刺对HIBD新生大鼠行为认知能力的影响;通过测定大脑湿重和冠状面、矢状面、水平面的直径评价HIBD大鼠脑部水肿与萎缩变化及针刺对其的影响;应用HE染色、Nissl染色观察针刺对HIBD大鼠海马形态和神经元结构的影响;应用TUNEL荧光染色观察针刺对HIBD大鼠海马神经元凋亡的影响;应用免疫组化观察针刺对HIBD大鼠神经元标志物NeuN和NF200的平均光密度值的影响,初步阐明针刺改善HIBD大鼠行为认知能力的病理学机制;(3)第三部分实验应用ELISA技术检测氧化应激相关指标ROS、MDA、SOD、GSH-px和炎症相关因子TNF-α、IL-1β、IL-18的表达,探讨针刺对HIBD大鼠血清氧化应激与炎症反应的影响;应用Western Blotting技术分别在PND1、PND3、PND7、PND14(针刺前)和PND28(针刺后)五个时间节点检测自噬相关蛋白LC3Ⅱ、P62、Lampl、Cathepsin D、Beclin 1 和 NLRP3 炎症体相关蛋白 NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、GSDMD的表达,探讨宫内窘迫HIBD大鼠脑部自噬与炎症反应随着缺血后再灌注的变化以及针刺对HIBD大鼠脑部自噬与NLRP3炎症体相关蛋白表达的影响;(4)第四部分实验添加了自噬激活剂RAPA(雷帕霉素)和抑制剂 CQ(氯喹),应用时序记忆测试和情景记忆测试观察针刺对HIBD大鼠行为认知能力的影响;应用Western blotting技术检测针刺对HIBD大鼠海马自噬相关蛋白LC3Ⅱ、P62、Lamp1、mTOR、p-mTOR和NLRP3炎症体活化相关指标NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、GSDMD的表达的影响;应用Real-time PCR技术检测针刺对HIBD大鼠相关基因Map1lc3a、Lampl、Khdrbs1、Nlrp3、Pycard、Gsdmd对应mRNA相对表达量的影响,进一步在分子基因层面阐明智三针通过调控自噬流的强度抑制NLRP3炎症体的活化从而减轻细胞死亡保护受损神经元的机制作用。结果:1.第一部分实验结果延迟10分钟剖宫产方法复制宫内窘迫HIBD新生大鼠模型。分别在各组大鼠PND3、PND7、PND14、PND21和PND28比较各组大鼠体重,结果显示在PND3,HIBD造模导致的缺血缺氧使新生大鼠体重减轻;在PND7和PND14,随着生长时间的增加,HIBD大鼠生长速度明显弱于正常分娩的大鼠;在PND21,HIBD导致新生大鼠体重增长缓慢,针刺干预7天后无显著变化;在PND28,HIBD模型大鼠体重增长缓慢,生长受到限制,而针刺干预14d有利于HIBD大鼠体重增长。各组大鼠改良后的mNSS神经功能缺损评分结果显示HIBD造模的大鼠神经功能明显受损,模型制作成功;针刺能有效改善HIBD模型大鼠的受损神经功能。2.第二部分实验结果(1)旷场实验结果在针刺干预7d后,HIBD模型鼠的旷场探索能力无明显改善作用。在针刺干预14d后,结果显示针刺可以显著提高HIBD模型鼠的旷场水平运和中央区探索能力,但无法明显改善HIBD大鼠旷场垂直探索能力且对HIBD大鼠的情绪影响不明显。(2)新物体识别实验和物体位置识别实验结果各组大鼠均可以识别新旧物体和物体位置。针刺可显著提升HIBD大鼠的新物体辨别能力和对物体位置的识别能力。(3)各组大鼠大脑湿重及各切面直径HIBD造模并未对使大鼠大脑产生明显水肿或萎缩;针刺对HIBD模型鼠的大脑大小和重量无明显影响。(4)各组大鼠脑部海马区HE染色结果正常组大鼠海马锥体细胞结构清晰,呈多角形,排列紧密整齐,胞核饱满,核仁深染清晰可见;模型组大鼠海马的锥体细胞排列散乱,间隙变宽,细胞肿胀导致形态改变,边界不清,大部分神经元坏死形成空泡,核仁固缩;针刺组大鼠海马锥体细胞排列较整齐致密,少部分神经元肿胀坏死,部分核仁清晰可见,边界较清晰,提示针刺有助于改善HIBD受损神经元的形态与结构。(5)各组大鼠脑部海马区Nissl染色结果正常组大鼠海马区锥体细胞排列整齐规律,部分细胞质着色不全,有少量尼氏体在锥体层两侧,部分核仁有固缩现象;模型组大鼠海马锥体细胞排列散乱,间隙明显变宽,胞体肿胀形成空泡,着色不深,核仁明显固缩;针刺组大鼠海马锥体细胞排列较整齐致密,部分核仁清晰可见,边界较清晰。提示HIBD导致新生大鼠海马区神经元肿胀坏死,针刺可有效缓解HIBD大鼠海马区的病理形态。(6)各组大鼠脑部海马Tunnel荧光染色结果宫内窘迫缺氧缺血可引起新生大鼠海马区神经元凋亡从而引起脑损伤;针刺可明显改善HIBD大鼠的海马区神经元凋亡现象。(7)各组大鼠脑部海马区免疫组化结果缺氧缺血导致大鼠海马NeuN表达下降,神经元受损,模型组和假针刺组细胞着色较正常组浅,且细胞排列明显散乱,间距增大;针刺14d可以有效改善大鼠受损海马区NeuN的表达。缺氧缺血导致大鼠海马神经元受损或坏死,NF200表达量显著降低;针刺可以有效改善大鼠受损海马区NF200的表达。3.第三部分实验结果(1)各组大鼠血清氧化应激指标结果:HIBD造模导致大鼠机体释放大量活性氧引起氧化应激反应;针刺可以有效减少血清ROS和MDA浓度,降低氧化应激反应。HIBD造模导致大鼠机体SOD浓度下降;针刺可以有效升高血清SOD和GSH-Px浓度,促进清除氧化应激反应产生的氧离子自由基,减轻细胞损伤。HIBD造模导致大鼠机体释放大量细胞炎性因子使机体受损;针刺可以有效降低血清炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-18的浓度,减轻细胞受损程度。(2)HIBD大鼠海马神经元自噬流与焦亡相关蛋白表达结果在PND1,HIBD造模导致机体缺血缺氧,自噬作用被激活清楚受损细胞器,同时激活了大鼠海马区NLRP3炎症体的合成和焦亡作用。在PND3,HIBD导致的机体自噬流降解作用继续增强,同时NLRP3炎症体介导的焦亡作用在继续增强。在PND7,HIBD导致的机体自噬流降解作用继续增强,同时NLRP3炎症体持续活化。在PND14,HIBD大鼠海马自噬诱导持续增强,降解作用无明显改变,同时炎症反应继续增强,脑损伤加重。(3)智三针对HIBD大鼠海马神经元自噬与NLRP3炎症体活化的影响针刺干预后,模型组大鼠海马LC3Ⅱ表达明显升高、P62表达明显降低、LAMP1的表达升高;针刺组大鼠海马LC3Ⅱ、P62、LAMP1的表达明显升高,而假针刺组无明显变化,提示针刺干预抑制HIBD大鼠海马过量自噬流。此外,模型组大鼠海马NLRP3、pro-caspase-1、caspase-1、ASC、IL-1β、GSDMD 表达明显升高;针刺组大鼠海马NLRP3、pro-caspase-1、caspase-1、ASC、IL-1β、GSDMD 表达明显降低,提示针刺干预可有效抑制HIBD大鼠海马神经元焦亡反应,保护受损细胞。4.第四部分实验结果(1)行为学检测结果各组大鼠均可以识别物体出现的先后顺序以及是否与背景匹配。时序记忆测试结果显示:HIBD造模严重降低了大鼠对物体出现顺序的识别能力,抑制自噬流可以显著改善这一现象;经过RAPA干预后的HIBD模型鼠产生了过量的自噬流,而此时针刺已经无法使其下降,脑损伤在不断加重从而导致大鼠的记忆能力始终处于较低水平;CQ组抑制过量自噬流有缓解大鼠的记忆力低下的趋势。情景记忆测试结果显示:HIBD造模严重降低了大鼠识别物体是否与环境匹配的能力,抑制自噬流可以显著改善这一现象;RAPA干预后的HIBD模型鼠产生了过量的自噬流,针刺后自噬流受到抑制,脑损伤减轻从而使大鼠的记忆能力提升;CQ抑制了过量的自噬流可以有效提升大鼠的物体辨别及记忆能力。(2)各组大鼠自噬相关蛋白表达结果模型组大鼠海马LC3Ⅱ表达明显增高、P62表达降低、LAMP1表达升高、P-mTOR/totalmTOR值降低,提示HIBD造模导致的缺氧缺血激活大鼠神经元自噬作用;针刺组大鼠LC3Ⅱ表达升高、P62表达升高、LAMP1表达降低、P-mTOR/otal mTOR值升高,提示针刺抑制自噬流的降解;RAPA组大鼠的LC3IⅡ表达明显升高、P62表达降低、P-mTOR/total mTOR值降低,LAMP1呈升高趋势,提示自噬流被持续过量促进,而CQ组大鼠的LC3Ⅱ、P62、LAMP1、P-mTOR/total mTOR值均升高,提示自噬流降解被抑制;针刺+RAPA组LC3 Ⅱ、P62表达升高,针刺+CQ组LC3Ⅱ、P62表达降低,提示针刺抑制HIBD大鼠的过量自噬流作用。(3)各组大鼠NLRP3炎症体相关蛋白表达结果模型组大鼠海马 NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1、IL-1β、GSDMD 表达升高,提示HIBD造模导致的缺氧缺血使大鼠神经元NLRP3炎症体活化,焦亡反应加重;针刺组大鼠海马 NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1、IL-1β、GSDMD 表达降低,提示针刺抑制HIBD大鼠神经元NLRP3炎症体活化;RAPA组大鼠海马ASC、pro-caspase-1、IL-1ββ表达升高,提示自噬流增强促使炎症反应加重,CQ组大鼠海马NLRP3、ASC、pro-caspase-1、GSDMD表达降低,提示降低过量自噬流可抑制神经元炎症。针刺+RAPA组大鼠海马ASC、pro-caspase-1、IL-1β、GSDMD表达降低,提示针刺可适量降低HIBD大鼠神经元过量自噬流从而抑制细胞炎症。(4)各组大鼠Real-time PCR结果模型组大鼠海马LC3、P62、LAMP1 mRNA的相对表达量升高;针刺组大鼠LC3、LAMP1 mRNA的相对表达量升高,P62降低,提示针刺干预抑制HIBD大鼠产生的过量自噬流;RAPA组大鼠LC3、P62、LAMP1 mRNA的相对表达量升高,提示RAPA促进HIBD大鼠自噬流增强;CQ组大鼠P62mRNA的相对表达量降低,提示CQ通过抑制自噬底物的生成进而抑制自噬。针刺+RAPA组P62 mRNA的相对表达量降低,提示针刺通过抑制自噬底物的生成抑制过量自噬流。此外,模型组大鼠海马NLRP3、ASC、GSDMD mRNA的相对表达量升高,针刺组大鼠海马NLRP3、ASC、GSDMD mRNA的相对表达量降低,提示针刺干预抑制HIBD大鼠细胞焦亡;RAPA组大鼠海马NLRP3、GSDMD mRNA的相对表达量升高,提示自噬流增强加重HIBD大鼠细胞焦亡;CQ组大鼠海马NLRP3、ASC、GSDMD mRNA的相对表达量降低,提示阻断自噬降解可以有效降低HIBD大鼠的焦亡反应。针刺+RAPA组NLRP3 mRNA相对表达量降低,针刺+CQ组NLRP3 mRNA相对表达量升高,提示针刺抑制NLRP3的生成进而抑制NLRP3炎症体活性,减弱HIBD大鼠的神经元焦亡反应。结论:本研究证实“智三针”改善宫内窘迫HIBD新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的可能机制是:通过调控大鼠海马区因缺氧缺血产生的自噬流,进而抑制神经元中NLRP3炎症体的活化,减少细胞死亡,保护受损神经元。