猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）是一种肠道冠状病毒,可造成猪只及未断奶仔猪急性水样腹泻和呕吐,致病性强,死亡率高,使得猪生产行业遭受严重的经济危机,实现对猪流行性腹泻病毒的快速现场检测是重大的产业需求。现有PEDV的检测方法主要有病毒的分离鉴定、酶联免疫吸附、聚合酶链式反应等,尽管在检测PEDV时这些手段起到了很大的帮助,但是它们仍然有着检测时间长、操作较为繁琐、对仪器设备要求高等缺陷,更重要的是在中国商业猪场里PEDV疫苗被广泛应用,但猪注射后易产生持续排毒,且不能完全免疫所有突变的野生型毒株,实验室检测时常无法快速鉴别野毒株与疫苗株。这些技术除了无法准确鉴别PEDV野毒株与疫苗株外,其存在的缺陷也阻碍了PEDV现场快速检测的应用与普及。因此,建立一种快速、易操作、灵敏且对设备要求低的临床检测方法具有重要的现实意义。CRISPR/Cas系统是一种存在于大多数细菌与所有的古菌中的防御机制,以消灭外来的质体或者噬菌体的DNA,广泛应用于基因工程中。近年来科学家们发现II类Cas蛋白Cas12a具有cr RNA指导的靶DNA激发的非特异性ss DNA切割活性,并将CRISPR-Cas系统应用于核酸检测领域,成为了体外诊断领域的研究热点。逆转录酶促重组酶扩增技术（RT-ERA）是通过逆转录酶、重组酶和单链结合蛋白,在恒定温度的设定下对模板上的目的基因进行指数式扩增,它突破了精密控温设备的限制。此外层析式双抗体夹心试纸条技术具有快速、便携的特点,将其与CRISPR/Cas12a技术结合,有望克服现有病原检测技术耗时长、操作繁琐、对仪器设备要求高等缺陷,带来更灵敏、特异、即时、简便的检测。CRISPR/Cas12a系统用于鉴别PEDV野毒株与疫苗株的研究目前未见报道,因此本研究利用CRISPR/Cas12a系统、RT-ERA等温扩增技术、荧光分析及试纸条信号输出等方式,针对PEDV的ORF3序列构建鉴别野毒株与疫苗株的快速检测方法。本研究主要内容如下:1.四株PEDV野毒株的ORF3基因的遗传进化分析本研究在检测结果为阳性的病料中选取4份病料,通过测序比对后得到4组ORF3基因序列,并将序列上传至NCBI数据库中。与24株PEDV毒株比较后,可知本研究所检测的4株毒株均属于G2型,且与疫苗株CV777的亲缘关系较远。本研究对PEDV野毒株的ORF3基因进化动向提供了参考依据。2.CRISPR/Cas12a可视化系统检测方法的建立本文建立了一种基于CRISPR/Cas12a系统的鉴别PEDV野毒株与疫苗株的检测方法。根据Gen Bank中公布的PEDV ORF3基因序列,使用Prime Premier 5.0软件设计了全长引物,构建了重组质粒p MD-19T-ORF3;针对PEDV野毒株与疫苗株在ORF3序列上的缺失部位设计2对cr RNA引物对、3对RT-ERA引物和探针,并对这些引物进行筛选,而后用筛选后的引物进行反应温度和时间的优化;以重组质粒为模板进行灵敏度及特异性试验。试验结果表明:第2对cr RNA引物对和第一对RT-ERA引物的效果较好,并用于下游试验;对反应条件进行优化后,最佳反应时间和温度分别为30 min和37℃;该试验的灵敏度达2 copies/μL,比q PCR高出10倍,且与其他病原没有交互性,并在对临床样品的检测中显示出较高的精确度,整个检测流程仅需60 min。3.CRISPR-LF检测方法的建立本研究在上述CRISPR可视化检测体系的基础上引入了层析式双抗体夹心试纸条技术,建立了一种CRISPR-Lateral flow strip（CRISPR-LF）检测方法,可通过裸眼检测,用CRISPR荧光检测体系筛选后的cr RNA引物和RT-ERA引物进行反应温度和时间的优化;以重组质粒为模板进行灵敏度及特异性试验。对反应条件进行优化后,最佳反应时间和温度分别为30 min和37℃;该试验的灵敏度达2×10~2 copies/μL,并在临床样本的检测时表现出良好的准确性和专一性。综上所述,本研究的建立的基于CRISPR/Cas12a系统鉴别PEDV野毒株与疫苗株检测方法与传统PCR和q PCR相比具有高灵敏度、强特异性、快速高效的特点,同时提高了检测的便携性,适合于试验资源匮乏的现场检测,在分子POCT检测领域具有良好的发展前景,对于PEDV早期诊断和预防控制具有重要意义。