【摘 要】
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弧菌（Vibrio,V.）是海水养殖环境主要病原菌,弧菌病频繁爆发是限制海水养殖业健康发展的重要因素。近年来,不少研究发现活体大型海藻分泌的抗生物质能有效抑制病原弧菌生长。细菌耐药性多由于环境中抗生压力诱导而获得,即使在低浓度水平也会影响细菌耐药性和耐药基因水平。然而,大型海藻分泌物对弧菌耐药性影响信息仍然较为缺乏。本实验采取大型海藻裂片石莼为代表性海藻,着重研究裂片石莼分泌物对海水养殖环境分离弧
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弧菌（Vibrio,V.）是海水养殖环境主要病原菌,弧菌病频繁爆发是限制海水养殖业健康发展的重要因素。近年来,不少研究发现活体大型海藻分泌的抗生物质能有效抑制病原弧菌生长。细菌耐药性多由于环境中抗生压力诱导而获得,即使在低浓度水平也会影响细菌耐药性和耐药基因水平。然而,大型海藻分泌物对弧菌耐药性影响信息仍然较为缺乏。本实验采取大型海藻裂片石莼为代表性海藻,着重研究裂片石莼分泌物对海水养殖环境分离弧菌的抑制特性以及追踪含亚抑菌水平裂片石莼分泌物环境弧菌耐药水平变化过程。主要内容如下:1、海水养殖环境弧菌分离及其耐药水平表征从不同海水养殖场水、泥、虾中筛选分离9株弧菌,包括3株溶藻弧菌（Va.）、4株副溶血弧菌（Vp.）、1株锡那罗州弧菌（Vs.）和1株梅氏弧菌（Vm.）。各弧菌24 h生长曲线的延迟期、对数生长期和稳定期分别为0-4 h、4-12 h和12-24 h,且初始菌悬液高浓度（1.0×10~5CFU/m L）条件下弧菌生长速度快于低浓度（1.0×10~3CFU/m L）。采用K-B法和微量肉汤稀释法表征各弧菌对18种常见抗生素的耐药水平,结果显示各弧菌具有氨苄青霉素、哌拉西林和阿莫西林三重或氨苄青霉素和阿莫西林双重耐药模式,且Va.和Vp.菌株均对链霉素中等耐药。氨苄青霉素、哌拉西林、阿莫西林和链霉素对各弧菌的最小抑菌浓度（MIC）在0.25-128μg/m L范围。2、裂片石莼分泌物对养殖分离弧菌的抑制特性收集不同密度（20、10、5、2.5、1.25 g/L）裂片石莼在人工海水培养不同天数后（1、3、5天）的水培液作为分泌物,分别与不同弧菌（1.0×10~5CFU/m L）共培养24 h。研究显示,各条件下裂片石莼分泌物对弧菌的抑制存在较强的时间依赖性,并随培养密度和作用时间延长而增强,均在12 h后对弧菌产生抑制作用。其中,培养1天的不同密度裂片石莼分泌物对各弧菌的抑制率在16 h后大于40%（比培养3天和5天的分泌物提前4-8 h）,且高密度（20 g/L）裂片石莼的分泌物在作用24 h后对各Va.和Vp.菌株抑制率均大于90%,弧菌数量无显著增长。因此,可判断裂片石莼分泌物对Va.和Vp.的MIC为20 g/L水培液。3、裂片石莼分泌物亚抑菌选择压下对连续传代弧菌的耐药水平影响分别以3株Va.和Vp.弧菌菌株为研究对象,研究裂片石莼分泌物亚抑菌（1/2 MIC、1/20 MIC、1/50 MIC）压力下弧菌连续传代培养20代后对常见抗生素的耐药性变化。结果表明,各亚抑菌水平下Va.和Vp.对氨苄青霉素和阿莫西林依然耐药,而Va.对哌拉西林和链霉素的耐药水平均从中等耐药变为敏感,Vp.对哌拉西林、链霉素、卡那霉素、庆大霉素和四环素的耐药水平则从敏感变为中等耐药。选择4种抗生素（氨苄青霉素、阿莫西林、哌拉西林和链霉素）进一步表征对弧菌的MIC水平,结果显示Va.和Vp.在1/2 MIC裂片石莼分泌物压力下,氨苄青霉素对Va.的MIC降低4倍,链霉素和哌拉西林对Vp.的MIC降低2-8倍。弧菌生物膜量和ROS水平发现,Va.和Vp.分别在1/2 MIC和1/50 MIC裂片石莼分泌物压力下的生物膜量显著减少,而Va.W1和Vp.R3在各浓度裂片石莼分泌物压力下ROS含量均显著减少。4、裂片石莼分泌物亚抑菌选择压下对连续传代弧菌的耐药机制通过转录组测序手段对亚抑菌裂片石莼分泌物作用下的第20代Va.S1和Vp.W3进行运动性、生物膜形成和抗生素抗性相关差异基因和通路分析。结果表明在1/2 MIC裂片石莼分泌物作用下,Va.S1富集在鞭毛组装、细菌趋化性、生物膜形成和抗生素抗性通路中的差异表达基因（Differentially Expressed Genes,DEGs）主要为下调基因,而在1/20 MIC和1/50 MIC压力下富集在述通路中的DEGs均为上调基因。Vp.W3在1/2 MIC裂片石莼分泌物作用下的DEGs均为上调基因;而1/20 MIC和1/50 MIC裂片石莼分泌物作用下,Vp.W3富集在上述4种通路中的DEGs主要为下调基因。
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