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第一部分:常氧肿瘤干细胞在结直肠癌原发灶中的检测、富集与鉴定目的:检测结直肠癌原发灶临床标本中的常氧肿瘤干细胞;探索结直肠癌常氧肿瘤干细胞与肿瘤分期、转移之间的关系;体外富集结直肠癌常氧肿瘤干细胞并鉴定。方法:使用两种方法检测结直肠癌常氧肿瘤干细胞:方法一:收集我院结直肠癌原发灶标本进行组织免疫荧光染色,基于CD31和HIF-1ɑ的表达,区分结直肠癌组织内部的常氧区域（CD31+HIF-1ɑ-）及乏氧区域（CD31-HIF-1ɑ+）,分别在常氧区域及乏氧区域统计CD133+细胞的比例,即为常氧肿瘤干细胞及乏氧肿瘤干细胞的比例。方法二:通过将结直肠癌原发灶标本消化成为单细胞,使用流式细胞术检测常氧肿瘤干细胞（Ep CAM+CD133+HIF-1α-）的比例。另外通过统计分析在不同肿瘤分期的临床组织标本中常氧肿瘤干细胞表达的差异,探索常氧肿瘤干细胞与肿瘤分期、转移之间的关系。使用两种方法在体外富集结直肠癌常氧肿瘤干细胞:方法一:将结直肠癌细胞,包括结直肠癌细胞系Lo Vo、SW480以及移植瘤细胞在常氧状态下进行细胞球体形成实验（Sphere-forming assay）,从而富集结直肠癌常氧肿瘤干细胞。方法二:使用乏氧反应元件（Hypoxia responsive elements,HRE）驱动GFP表达（p-HRE-GFP）的慢病毒感染结直肠癌细胞,通过流式分选出CD133+GFP-细胞,即为结直肠癌常氧肿瘤干细胞。通过Western-blot实验验证不同方法富集的结直肠癌常氧肿瘤干细胞中CD133、Nanog、Sox2及HIF-1ɑ的表达。结果:组织免疫荧光及流式检测显示结直肠癌组织内部存在常氧肿瘤干细胞及乏氧肿瘤干细胞。此外,肿瘤分期越晚,常氧肿瘤干细胞的比例越高。更重要的是,在IV期结直肠癌患者的原发灶组织中,常氧肿瘤干细胞的比例高于乏氧肿瘤干细胞。Western-blot实验结果显示,细胞球体形成实验及流式分选富集的结直肠癌常氧肿瘤干细胞高表达CD133、Sox2及Nanog,同时低表达HIF-1α。结论:结直肠癌原发灶中存在常氧及乏氧肿瘤干细胞。结直肠癌常氧肿瘤干细胞的比例与肿瘤分期及转移呈正相关。常氧条件下细胞球体形成实验及流式分选可以在体外稳定富集结直肠癌常氧肿瘤干细胞。第二部分:乳酸通过氧化磷酸化途径促进结直肠癌常氧肿瘤干细胞体外侵袭、迁移及体内转移目的:探索乳酸对结直肠癌常氧肿瘤干细胞转移能力的影响;探索结直肠癌常氧肿瘤干细胞与其他肿瘤细胞亚群代谢特征的差异;探索乳酸是否通过氧化磷酸化途径影响结直肠癌常氧肿瘤干细胞的体外侵袭、迁移及体内转移能力。方法:在结直肠癌常氧肿瘤干细胞培养基中添加乳酸,Transwell侵袭实验及划痕实验检测结直肠癌常氧肿瘤干细胞体外侵袭和迁移能力的改变;细胞免疫荧光及Western-blot实验检测乳酸对结直肠癌常氧肿瘤干细胞上皮细胞-间充质转化（Epithelial-mesenchymal transitions,EMT）的影响。小鼠肺转移模型检测乳酸对结直肠癌常氧肿瘤干细胞转移潜能的影响。使用乏氧培养箱或Co Cl2诱导肿瘤细胞乏氧,然后使用细胞球体形成实验或流式细胞分选在体外富集结直肠癌常氧及乏氧肿瘤细胞亚群,Western-blot实验验证并检测其代谢特征。使用乳酸检测试剂盒检测结直肠癌常氧肿瘤干细胞及其他肿瘤细胞亚群培养基中的乳酸浓度。收集乳酸分泌细胞的条件培养基（Conditioned medium,CM）,使用细胞免疫荧光、ATP检测、Westernblot等实验检测乳酸分泌细胞的条件培养基对结直肠癌常氧及乏氧肿瘤干细胞氧化磷酸化的影响。慢病毒敲减单羧酸转运蛋白1（Monocarboxylate transporter1,MCT1）及乳酸脱氢酶B（Lactate dehydrogenase B,LDHB）,通过细胞氧耗率实验（Oxygen consumption rates,OCR）、Transwell侵袭实验及划痕实验检测乳酸分泌细胞的条件培养基对结直肠癌常氧肿瘤干细胞氧化磷酸化活性以及体外侵袭及迁移能力的影响。结果:Transwell侵袭实验及划痕实验显示乳酸促进结直肠癌常氧肿瘤干细胞体外侵袭和迁移。细胞免疫荧光及Western-blot实验结果显示乳酸促进结直肠癌常氧肿瘤干细胞上皮细胞-间充质转化。小鼠肺转移实验显示乳酸促进结直肠癌常氧肿瘤干细胞体内转移潜能。Western-blot实验显示乏氧处理后,细胞中HIF-1α高表达,结合细胞球体形成实验或流式细胞分选可在体外富集肿瘤细胞亚群。乳酸检测试剂盒检测显示结直肠癌常氧肿瘤干细胞培养基中乳酸浓度明显低于其他肿瘤细胞亚群,Western-blot实验显示结直肠癌常氧肿瘤干细胞中线粒体外膜转位酶20（Translocase of the outer membrane 20,TOM20）蛋白的表达高于其他肿瘤细胞亚群。细胞免疫荧光、ATP检测、Western-blot等实验结果显示乳酸分泌细胞的条件培养基增强结直肠癌常氧肿瘤干细胞氧化磷酸化活性。ATP检测实验和OCR实验结果显示敲减结直肠癌常氧肿瘤干细胞中的MCT1或LDHB后,乳酸分泌细胞的条件培养基增强结直肠癌常氧肿瘤干细胞氧化磷酸化活性的能力被削弱,此外,Transwell侵袭实验及划痕实验结果显示乳酸分泌细胞的条件培养基促进结直肠癌常氧肿瘤干细胞体外迁移和侵袭的能力被削弱。结论:乳酸促进结直肠癌常氧肿瘤干细胞体外侵袭、迁移、EMT及体内转移。乏氧处理结合细胞球体形成实验或流式细胞分选可在体外富集肿瘤细胞亚群。结直肠癌常氧肿瘤干细胞具有高氧化磷酸化活性,而其他肿瘤细胞亚群倾向于糖酵解。乳酸分泌细胞的条件培养基增强结直肠癌常氧肿瘤干细胞氧化磷酸化活性。抑制乳酸摄取后,乳酸分泌细胞的条件培养基促进结直肠癌常氧肿瘤干细胞体外侵袭及迁移能力被削弱。第三部分:乳酸通过PGC-1α调控的氧化磷酸化途径促进结直肠癌常氧肿瘤干细胞转移目的:探讨PGC-1α对结直肠癌常氧肿瘤干细胞线粒体生物合成及氧化磷酸化活性的调节。探讨乳酸是否通过PGC-1α影响结直肠癌常氧肿瘤干细胞氧化磷酸化活性及转移能力。探讨HIF-1α对结直肠癌常氧肿瘤干细胞氧化磷酸化活性及体外侵袭及迁移能力的调节。方法:Western-blot实验检测结直肠癌常氧肿瘤干细胞中PGC-1α的蛋白表达水平。敲减PGC-1α后,RT-PCR检测结直肠癌常氧肿瘤干细胞中线粒体生物合成相关基因m RNA表达水平的变化。电子显微镜检测结直肠癌常氧肿瘤干细胞中线粒体数量的变化。乳酸分泌细胞的条件培养基处理敲减PGC-1α的结直肠癌常氧肿瘤干细胞,检测细胞氧耗率、ATP水平的变化,Transwell侵袭实验及划痕实验检测其体外侵袭和迁移能力的变化。小鼠肺转移模型检测敲减PGC-1α后,乳酸分泌细胞的条件培养基对常氧肿瘤细胞的肺转移潜能的影响。使用脯氨酸羟化酶结构域2（prolyl hydroxylase domain 2,PHD2）抑制剂处理结直肠癌常氧肿瘤干细胞,抑制HIF-1α的降解,细胞氧耗率实验检测结直肠癌常氧肿瘤干细胞氧化磷酸化活性的变化,Transwell侵袭实验及划痕实验检测结直肠癌常氧肿瘤干细胞体外侵袭和迁移能力的变化。结果:Western-blot实验结果显示结直肠癌常氧肿瘤干细胞中PGC-1α的蛋白表达水平高于其它肿瘤细胞亚群。敲减PGC-1α后,电子显微镜及RT-PCR实验结果显示结直肠癌常氧肿瘤干细胞的线粒体数量及线粒体生物合成基因的表达显著降低。细胞氧耗率实验、ATP检测等实验结果显示,敲减PGC-1α后,乳酸分泌细胞的条件培养基增强结直肠癌常氧肿瘤干细胞氧化磷酸化活性的能力被削弱。Transwell侵袭实验、划痕实验及小鼠肺转移模型实验结果显示,敲减PGC-1α后,乳酸分泌细胞的条件培养基增强结直肠癌常氧肿瘤干细胞侵袭、迁移及体内转移潜能的能力被削弱。Western-blot实验结果显示,抑制HIF-1α降解后,结直肠癌常氧肿瘤干细胞中HIF-1α的蛋白表达水平升高,同时PGC-1α的蛋白表达水平下降。细胞氧耗率实验、Transwell侵袭实验及划痕实验结果显示,HIF-1α高表达后,乳酸分泌细胞的条件培养基增强结直肠癌常氧肿瘤干细胞氧化磷酸化活性及体外侵袭及迁移的能力被削弱。结论:PGC-1α调节结直肠癌常氧肿瘤干细胞的线粒体生物合成及氧化磷酸化活性。乳酸通过PGC-1α调节结直肠癌常氧肿瘤干细胞氧化磷酸化活性,进而增强其转移潜能。HIF-1α负向调控PGC-1α的表达。HIF-1α高表达后,乳酸分泌细胞的条件培养基增强结直肠癌常氧肿瘤干细胞氧化磷酸化活性及体外侵袭及迁移的能力被削弱。