1辐照对HBVP细胞的影响目的:放射性脑损伤是头颈部肿瘤（head and neck cancer,HNC）放疗后严重并发症之一。人脑血管周细胞（Human Brain Vascular Pericytes,HBVP）在维持血脑屏障（Brain Blood Barrier,BBB）结构的完整性中发挥重要作用。研究显示头部放疗后可以通过影响脑血管周细胞功能进而引起BBB破坏,导致放射性脑损伤。本研究通过研究HBVP细胞照射后功能变化,为放疗后BBB破坏提供理论支持,为治疗和改善放射性脑损伤提供思路。方法:本研究采用Western Blot方法检测HBVP细胞照射0 h、6 h、12 h、24 h、48h和72 h后细胞内蛋白水平的表达情况,主要包括自噬、凋亡和炎症因子相关蛋白的表达水平,反映HBVP细胞在放射线照射后细胞功能的变化。同时,采用细胞免疫荧光实验比较辐照前和辐照后48 h HBVP细胞内半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase3）的平均免疫荧光强度,以及通过流式细胞学检测辐照后HBVP细胞凋亡比例,反映HBVP细胞在辐照前后的凋亡水平变化。结果:研究中比较辐照前后HBVP细胞中自噬特异性微管相关蛋白1A/1B轻链3B蛋白II（Microtubule-associated protein 1A/1B Light Chain 3B Protein II,LC3BII）和P62/SQSTM1（以下简称P62）的蛋白表达水平,结果显示LC3BII和P62在HBVP细胞辐照后表达增加,说明辐照后HBVP细胞内P62降解障碍,自噬通量阻断,自噬功能受限。同时对辐照前后HBVP细胞的凋亡蛋白进行检测,结果显示剪切型半胱氨酸蛋白酶-3（cleaved-Caspase3）等凋亡代表性蛋白在辐照后表达增加,提示放射线处理能够诱导HBVP细胞的凋亡。通过流式细胞学和细胞免疫荧光学检测,进一步证实辐照可以诱导HBVP细胞的凋亡。同时在辐照后,HBVP细胞中基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase,MMP9）和CC基序趋化因子配体2（C-C motif chemokine ligand 2,CCL2）的表达上调,同时放射线处理能够上调核因子κB（the nuclear factorκB,NF-κB）信号通路,说明放疗能够激活炎症反应相关通路。结论:辐照可阻断HBVP细胞自噬,增加HBVP细胞凋亡,并可能通过激活NF-κB信号通路促进炎症因子表达。2自噬对辐照后HBVP细胞凋亡及衰老的影响目的:通过激活自噬或抑制自噬在不同疾病的治疗上取得一定进展,本研究拟通过药物和si RNA干扰HBVP细胞自噬功能,探索自噬对辐照后HBVP细胞凋亡及衰老的影响。方法:通过使用自噬抑制剂3-甲基腺苷（3-Methyladenosine,3-ma）、巴弗洛霉素（Bafilomycin A1,Baf A1）,自噬激活剂平衡盐溶液（Earle’s Balanced Salt Solution,EBSS）、雷帕霉素（Rapamycin）等药物以及si RNA下调自噬相关基7（Autophagy-related genes 7,ATG7）（简称si-ATG7）预处理HBVP细胞24 h,后进行辐照处理。通过q RT-PCR检测si RNA敲低效率,再通过Western Blot检测预处理后的HBVP细胞在辐照后48 h细胞内蛋白水平的变化,主要检测自噬、凋亡和炎症因子的表达水平。通过检测HBVP细胞在辐照后5 d衰老相关蛋白的表达水平,对HBVP细胞进行衰老相关特异性的β-半乳糖苷酶（Senesence Associatiedβ-Galactosidase,SA-β-gal）染色,统计阳性细胞数量。通过细胞免疫荧光实验检测自噬功能干预后HBVP细胞在辐照前和辐照后48 h细胞内Caspase3的平均免疫荧光强度,通过流式细胞学检测凋亡细胞比例,检测辐照对细胞凋亡水平的影响。结果:通过比较干预自噬功能后的HBVP细胞在辐照前后细胞内自噬相关蛋白LC3BII和P62的表达水平,结果显示在HBVP细胞添加自噬激活剂或自噬阻断剂预处理后,导致HBVP细胞辐照后较辐照前自噬相关蛋白LC3BII表达增加,同时出现P62降解障碍,说明在自噬功能激活或者抑制的前提下,辐照均可导致HBVP细胞中自噬功能损伤;下调HBVP细胞中ATG7的表达时,辐照后自噬功能损伤更加明显。同时在自噬激活剂、自噬抑制剂和si RNA预处理后,辐照后炎症因子表达增加并诱导细胞凋亡,其中自噬抑制剂诱导HBVP细胞凋亡的作用最为显著。另外,本研究发现给予10 Gy放射线照射能够诱导HBVP细胞衰老,添加自噬激活剂后辐照诱导HBVP细胞衰老的作用更加显著。细胞自噬功能紊乱的情况下,检测细胞炎症因子表达水平,结果显示辐照前后均存在炎症通路的激活,炎症因子表达增加。同时检测检PI3K/AKT和NF-κB信号通路,结果提示辐照后PI3K/AKT信号通路下调,NF-κB信号通路上调。结论:自噬功能正常是维持HBVP细胞正常功能的基础。HBVP细胞自噬水平紊乱时,放射线可能通过下调PI3K/AKT信号通路同时激活NF-κB信号通路,诱导HBVP细胞的衰老,促进HBVP细胞的凋亡,促进炎症因子的表达。3条件性敲除小鼠脑周细胞自噬相关基因ATG7,对放射性脑损伤的影响目的:脑血管周细胞在维持BBB结构完整性和功能稳定性中发挥重要作用,全脑放疗后不可避免损伤BBB的完整性。本研究通过条件性敲除小鼠脑血管周细胞自噬相关基因,探究自噬对辐照后小鼠自噬、衰老和BBB的影响,同时检测辐照前后小鼠认知功能,研究自噬和衰老在放射性脑损伤中的作用。方法:通过构建Atg7flox/flox;Pdgfrb-Cre转基因小鼠,经PCR电泳筛选出目的基因小鼠,并对小鼠进行繁育,得到基因型为Atg7flox/flox;Pdgfrb-Cre的小鼠作为实验组小鼠以及基因型为Atg7flox/flox的小鼠作为对照组小鼠。繁育获得一定数量后,对其进行15 Gy照射剂量的全脑照射,构建放射性脑损伤小鼠模型。提取辐照后3个月小鼠脑组织蛋白,检测小鼠脑中自噬、衰老蛋白的表达水平;通过检测小鼠脑中CD31、CD68、胶质纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein,GFAP）和Neun蛋白表达水平,检测辐照对小鼠脑组织中内皮细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元细胞功能的影响;进行衰老相关蛋白P16和血小板源性生长因子β（Platelet-drived growth factor receptor beta,PDGFRβ）免疫荧光共染,探索辐照对周细胞自噬功能缺陷小鼠周细胞衰老的影响;对反映BBB完整结构的紧密连接蛋白（tight junction,TJ）ZO-1进行免疫荧光染色,探究BBB结构在辐照前后的变化;同时对小鼠进行行为学试验,主要检测旷场试验（Open field test,OFT）和新物体识别试验（New object recognition,NOR）,评价小鼠辐照前后认知功能水平。结果:辐照后,小鼠脑组织中LC3BII、P62表达增加,提示P62降解受阻,小鼠自噬功能障碍,与体外细胞试验结果一致;在Atg7flox/flox;Pdgfrb-Cre转基因小鼠中辐照后P16表达较对照组增加,表明周细胞自噬功能缺陷可加重因辐照导致的周细胞衰老;辐照后TJ相关蛋白ZO-1免疫荧光染色结构紊乱,提示辐照可以破坏BBB结构的完整性,并且BBB结构在周细胞自噬功能缺陷的情况下受放射线的影响更加显著;在小鼠行为学实验中,显示辐照能够损伤小鼠认知功能,而且在Atg7flox/flox;Pdgfrb-Cre转基因小鼠中,认知功能损伤更加显著。结论:小鼠头部照射可损伤脑血管周细胞自噬功能,诱导衰老,破坏BBB结构,损伤认知功能,周细胞自噬功能缺陷可加重上述改变。