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本实验利用牛胃重组全长野生型MLCK,对其1002-1022氨基酸(即CaM结合位点)进行定点突变,使牛胃MLCK cDNA序列中的T3016、G3017、A3052、G3053、A3054、C3055、T3056 突变为G3016、C3017、G3052、C3053、G3054、G3055、C3056,在氨基酸水平上Trp1006、Arg1018、Leu1019将被突变为Ala。并利用大肠杆菌表达系统成功地进行了大量表达,经纯化获得了重组的MLCK突变体。检测了重组MLCK突变体对肌球蛋白的Mg2+-ATP酶活性的影响、MLCK突变体与肌动蛋白的结合的活性以及对体外肌丝运动的影响,进一步证明了MLCK的非激酶活性在平滑肌收缩过程中的调节作用。
方法:根据牛胃重组全长野生型MLCK的cDNA序列设计两条突变引物,通过PCR反应进行定点突变。在大肠杆菌中表达重组全长野生型MLCK(WT/MLCK)和CaM结合位点突变型MLCK(△CaM/MLCK),通过亲和层析及凝胶过滤进行分离纯化。SDS-PAGE检测表达及纯化的重组蛋白。Glycerol-PAGE检测重组MLCK对MLC20的磷酸化水平。孔雀绿方法检测重组MLCK突变体对肌球蛋白的Mg2+-ATP酶活性的影响。蛋白结合实验检测Ca2+/CaM对重组MLCK与肌动蛋白结合活性的影响。体外肌丝运动实验(in vitro motility assay)检测重组MLCK对肌动蛋白肌丝运动速度的影响。
结论:本实验得到如下结论:1.通过定点突变获得重组MLCK钙调蛋白结合位点突变体(△CaM/MLCK)并可以在大肠杆菌中以可溶形式大量表达;经亲和层析和凝胶过滤获得较纯的重组MLCK。2.△CaM/MLCK失去了磷酸化肌球蛋白20KD调节轻链的激酶活性。3.通过重组突变型MLCK(△CaM/MLCK)对肌球蛋白Mg2+-ATP酶活性的影响表明MLCK具有非激酶活性。在无Ca2+/CaM条件下,激活非磷酸化肌球蛋白的Mg2+-ATP酶活性;抑制磷酸化肌球蛋白的Mg2+-ATP酶活性。4.结合实验结果表明:Ca2+/CaM通过MLCK的1002-1022位氨基酸(CaM结合位点)影响了MLCK与肌动蛋白的结合。5.由体外运动实验结果推测Ca2+/CaM是通过MLCK的1002-1022位氨基酸(CaM结合位点)影响MLCK与肌动蛋白的结合,进而调节了肌动蛋白与肌球蛋白的相互运动。