研究背景头颈鳞状细胞癌(HNSCC)主要包括来自口腔的、口咽的和喉部的肿瘤,并在全球恶性肿瘤中排第六位。在过去的30年中其生存率并没有明显的提高,并且约有50%的患者在确诊后5年内因该病去世。超过50%的头颈鳞癌病人都受到淋巴结转移的困扰,并且淋巴结转移也是与患者较差的长期生存率密切相关的最重要预后因素之一。目前最有效的治疗手段仍然是手术,只有尽早发现,并尽早采取措施才有可能将肿瘤彻底切除,防止肿瘤进展,保证患者的生命健康。Micro RNA作为一种重要的内源性RNA分子体系,在动物中通过与其同源的m RNA靶标的3’UTR这一特定序列相互作用从而发挥基因调控作用,导致了其靶标m RNA的降解或其翻译过程受到抑制。现在已经非常肯定的明确了mi RNAs在细胞的增殖、分化和凋亡等重要的细胞生命活动中发挥重要的调控作用。已经有一部分mi RNA被识别并被确认为恶性肿瘤的诊断和预后分子标志物。目前,头颈鳞癌的治愈率仍然不高,所以非常有必要寻找与头颈鳞癌相关的高灵敏度和特异性的mi RNA分子,作为头颈鳞癌诊断或治疗的标志物。在本项研究中,我们通过实时定量PCR技术检测了不同转移潜能的头颈鳞癌样本中的mi R-645表达水平,并分析其表达与头颈鳞癌临床病理参数的相关性。首先,我们应用实时定量PCR技术检测其在2株头颈鳞癌细胞中的表达水平。采用瞬时转染的方法将mi R-645mimics或mi R-645inhabitor转入头颈鳞癌细胞株,从而上调或下调mi R-645的表达水平。然后通过CCK8法检测细胞的增殖状况,应用Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭能力,通过划痕实验检测细胞的迁移能力,通过克隆形成实验检测细胞的克隆形成能力,以了解mi R-645对头颈鳞癌细胞的生物学行为的影响,以进一步阐明mi R-645在头颈鳞癌发生、发展中的作用。并通过线性回归分析分析了mi R-645与其可能的靶基因IFIT2的关系,为以后深入研究mi R-645的分子机制奠定基础。第一部分探究mi R-645在不同转移潜能的头颈鳞癌组织中的表达及其与临床参数的相关性分析目的研究mi R-645在不同转移潜能的头颈鳞癌组织中和细胞中的表达及临床意义。方法采用实时定量PCR(real-time PCR)检测取自头颈鳞癌患者的癌组织中的mi R-645的表达水平,其中包括:76例伴有淋巴结转移的头颈鳞癌组织和51例无淋巴结转移的头颈鳞癌组织。通过独立样本t检验和单因素方差分析的统计方法研究其表达水平与患者年龄、性别、临床分期等临床病理参数之间的相关性。结果1.mi R-645在不同转移潜能的头颈鳞癌组织中的表达水平。通过real-time PCR技术检测mi R-645在不同转移潜能的头颈鳞癌组织中的表达水平。结果表明伴有淋巴结转移的76例头颈鳞癌组织中的mi R-645的相对表达量是2.71±0.24,而在无淋巴结转移的51例头颈鳞癌组织中则为1.58±0.23,两者对比有统计学差异(p<0.05)。2.采用t检验和单因素方差分析研究mi R-645的表达水平与头颈鳞癌的临床病理参数的相关性。结果表明mi R-645的表达水平与肿瘤的病理分级、淋巴结转移及脉管栓塞、浸润神经、弥漫性浸润等反应肿瘤恶性程度病理指标呈显著相关(p<0.05),而与头颈鳞癌患者的性别、年龄、肿瘤的大小、肿瘤的发生部位、吸烟史和饮酒史均无明显相关性(p>0.05)。小结1.伴有转移特性的头颈鳞癌组织中的mi R-645的表达水平明显高于无转移特性的头颈鳞癌组织,提示mi R-645的表达上调可能促进了头颈鳞癌的转移能力。2.头颈鳞癌组织中mi R-645的表达水平与病理分级、淋巴结转移、肿瘤恶性程度指征(肿瘤内血管栓塞、浸润神经、弥漫性浸润)显著相关,提示mi R-645可能在头颈鳞癌的发生及发展阶段起关键性作用,有成为肿瘤早期诊断标志物的潜能。第二部分mi R-645对头颈鳞癌细胞生物学功能的影响目的通过外源性干预措施改变mi R-645的表达水平,研究其对头颈鳞癌细胞系HN4和HN12生物学行为的影响及并探索其机制。方法采用实时定量PCR(real-time PCR)法检测两株头颈鳞癌细胞系HN4和HN12中的mi R-645的表达水平,并通过瞬时转染的方式将mi R-645mimics转染进入HN4细胞中,以获得高表达mi R-645细胞模型,同时分为三组:空白组、阴性对照组(NC组)和转染mi R-645mimics组;转染mi R-645inhabitor进入HN12细胞中,以获得低表达mi R-645细胞模型,同时分为三组:无转染组、阴性对照组(inhabitor-NC组)和转染mi R-645inhabitor组。然后通过CCK8法检测头颈鳞癌细胞的增殖能力;Transwell侵袭实验、划痕实验和克隆形成实验分别检测头颈鳞癌细胞侵袭能力、转移能力和克隆形成能力的影响。此外,通过统计学分析(线性回归分析)探测mi R-645与IFIT2之间的关系。结果1、实时定量PCR证明转移能力较强的HN12细胞比转移能力较弱的HN4细胞mi R-645表达水平要高,结果分别为:2.07±0.250和0.97±0.21,差异有统计学意义(P=0.003)。2、实时定量PCR检测结果显示,转染mi R-645mimics组的HN4细胞中mi R-645的表达量显著高于空白组和阴性对照组(p<0.05)。转染了mi R-645inhabitor组的HN12细胞中mi R-645的表达量显著低于空白组和阴性对照组(p<0.05)。3.转染mi R-645mimics组的HN4细胞的增值率在第5天和7天时明显较阴性对照组高,并且差异有显著性(p<0.05)。转染了mi R-645inhabitor组的HN12细胞的存活率在在第5天和7天时明显较阴性对照组低,并且差异有显著性(p<0.05)。4.转染mi R-645mimics组的HN4细胞穿过PVDF膜的数量明显高于阴性对照组,并且差异有显著性(p<0.05)。转染了mi R-645inhabitor组的HN12细胞穿过PVDF膜的数量明显低于阴性对照组,并且差异有显著性(p<0.05)。5.转染mi R-645mimics组的HN4细胞转移能力明显高于阴性对照组,转染了mi R-645inhabitor组的HN12细胞的侵袭数明显低于阴性对照组(p<0.05)。6.转染mi R-645mimics组的HN4细胞克隆形成能力明显高于阴性对照组,并且差异有显著性(p<0.05)。转染了mi R-645inhabitor组的HN12细胞的单克隆形成能力明显低于阴性对照组,并且差异有显著性(p<0.05)。7.mi R-645与IFIT2之间呈负相关性,相关系数为0.181,且有统计学意义(p=0.001)。小结1.通过体外细胞实验,成功的实现了头颈鳞癌细胞中mi R-645的表达上调和下调,并且上调mi R-645能够增强头颈鳞癌细胞的增殖、侵袭、转移及单克隆形成等能力,mi R-645能够改变头颈鳞癌细胞的生物学行为,可能发挥促癌作用。2.IFIT2可能是mi R-645下游靶基因,mi R-645可能通过调控IFIT2的表达,进而影响头颈鳞癌细胞生物学功能。结论1.mi R-645在头颈鳞癌组织中表达上调,且与头颈鳞癌的转移及预后密切相关;2.mi R-645的改变能够明显影响头颈鳞癌细胞的增殖、侵袭及转移等生物学行为,有成为肿瘤早期诊断标志物的潜能;3.mi R-645可能通过直接调控IFIT2的表达,进而影响头颈鳞癌细胞生物学行为。