DNA酶是一种重要的人工模拟酶,具有分子量小、易合成、低成本、热稳定性高、可编程等优势,在疾病精准诊断、分子影像、肿瘤诊疗等领域具有广泛的应用前景。然而,目前DNA模拟酶的催化性能与蛋白酶相比仍有一定的差距,极大限制了其应用。因此,提高模拟酶的催化性能,构建高效、稳定的DNA酶是DNA模拟酶相关研究中的关键问题。本论文整合临床检验诊断学、生物分析化学以及纳米科学等多学科最新研究成果,深入探讨了DNA/氯化血红素（Hemin）模拟酶的催化活性和反应机理;发展了一系列具有高效催化能力、性质稳定、环境耐受力强的DNA酶;建立了基于DNA酶的核酸、小分子、细胞膜蛋白等多种疾病标志物高灵敏检测新方法。本研究不仅为无酶检测体系提供了新的理论和技术支持,而且为人工模拟酶的开发提供了新思路。本研究主要包括以下三个部分:1.DNA-Hemin酶与传统G4/Hemin酶的荧光催化性能对比分析以Hemin与寡核苷酸链共价结合为基础的模拟酶（DNA-Hemin酶）作为生物传感应用中的催化剂引起了研究者的广泛关注,然而其结构变构模式和催化性能仍然需要进一步探究。本研究提出了一种概念类比分析策略,比较DNA共价结合的Hemin酶（DGH）与经典G-四链体/氯化血红素（G4/Hemin）酶催化和分析性能。首先设计了两个类似的靶标触发催化活性的荧光催化体系,比较二者作为分子识别探针和催化剂的无酶荧光传感分析性能。结果表明,尽管G4/Hemin表现出更好的催化能力,但DGH具有背景低,催化速率快,耐受性好和靶标触发构象转换效率高等优点。此外,以miRNA-21作为模型分析物时,DGH体系的最低检测限为0.17 nM,约为G4/Hemin的20倍,表明DGH体系在荧光生物传感策略中具有更好的灵敏度和剂量响应能力。因此,DGH酶是一种出色的无酶信号转导工具,具有广阔的应用前景。2.动态DNA自组装激活的DNA-Hemin酶系统的荧光生物传感应用本研究建立了动态DNA自组装激活的Hemin模拟酶系统,实现多功能的荧光生物传感检测。与DNA共价结合的Hemin探针不仅可以作为动态DNA自组装的模块,还充当可调谐的模拟酶工具。当靶标存在时,熵驱动的动态DNA组装启动回路,将标记于DNA链末端的活性钝化的Hemin二聚体解离为活化的单体,使得激活的DNA-Hemin模拟酶可以催化无荧光的酪胺底物产生荧光信号,实现简单、快速、无酶的检测。该策略适用于多种靶标的检测:检测核酸靶标-GBS基因时,最低检测限和线性范围分别为78 pM和0.1-50 nM,检测时间为40分钟;检测小分子靶标可卡因时,检测限为4.85μM,检测时间为70分钟。该检测系统的优点在于可调谐的模拟酶激活机制,仅需设计简单的DNA组装寡核苷酸模块,无需添加额外Hemin的快速组装等。本工作提出的简单、通用的靶标触发激活的DNA-hemin酶系统可实现高效的无酶信号转导,有望成为广泛应用的生物传感工具。3.拉链式组装的高效DNA酶催化性能研究及其生物分析应用G4/Hemin酶能够模拟辣根过氧化物酶（HRP）的催化活性,被广泛应用于生物传感、生物医学工程以及疾病诊疗等领域,成为不可或缺的人工模拟酶系统。然而,如何进一步提高其催化性能,使其能与蛋白酶相媲美,仍是研究人员不断追求的目标。本工作在前期研究基础上,构建了一种基于邻位组装的新型G4/hemin DNA酶,具有出色的HRP模拟催化特性,称之为拉链式组装的DNA酶（Z-G4/H）。Z-G4/H催化活性和机制的研究结果揭示其组装模式（与Hemin共价结合的寡核苷酸链（DNA-Hemin）与包含G4序列和腺嘌呤核苷酸的互补链的杂交互补）高度模拟蛋白酶辅因子和酶蛋白紧密结合的构型。与传统的离子依赖型组装的G4/Hemin DNA酶相比,Z-G4/H体系具有催化活性高,催化速率快,环境依赖性低,环境耐受力强等优点。此外,基于Z-G4/H酶构建的体系实现了BCR-ABL融合基因和乳腺癌细胞表面人类表皮生长因子受体2（HER2）二聚体高灵敏检测,充分证明了Z-G4/H酶在疾病标志物检测、体内生物大分子相互作用研究等领域具有广阔的应用潜力。本工作提出的拉链式组装的G4/Hemin DNA酶为开发与天然蛋白酶相当的模拟酶提供了新的启发和机会。