论文部分内容阅读
第一部分GSK2334470和PP242对eNOS激活的影响目的:内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase,eNOS）对维持心血管系统功能具有重要作用,其表达或激活异常与很多心血管疾病密切相关。eNOS在Ser 1177位点的磷酸化水平是其功能激活的重要标志。作为eNOS的主要上游调控蛋白,蛋白激酶B（protein kinase B,PKB/Akt）可以通过自身不同位点的磷酸化调节eNOS的激活,Akt的活化需要通过自身Thr308和Ser473两个位点磷酸化才能达成,其活性可以分别被GSK2334470和PP242所抑制,本部分主要研究GSK2334470和PP242对eNOS激活的影响。方法:建立eNOS-HEK293细胞（转染人来源eNOS质粒的HEK293细胞）、原代人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）和牛主动脉内皮细胞（bovine aortic endothelial cells,BAECs）三种细胞系,使用不同浓度和时间的磷脂酰肌醇依赖蛋白激酶1（phosphoinositide dependent kinase-1,PDK1）和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）特异性抑制剂GSK2334470及PP242分别处理上述细胞;Western Blot检测Akt和eNOS磷酸化水平的变化。结果:（1）eNOS-HEK293细胞成功表达eNOS蛋白;HUVECs和BAECs光镜下呈鹅卵石和铺石样排列,CD31和Ⅷ因子荧光染色呈阳性。（2）与control组相比,GSK2334470呈浓度依赖性抑制Akt Thr308磷酸化水平（P<0.05）,但不影响Akt Ser473的磷酸化（P>0.05）;p-Akt Thr308和p-eNOS Ser1177/1179随GSK2334470处理时间增加而下调（P<0.05）。（3）与control组相比,PP242呈浓度依赖性抑制Akt Ser473磷酸化水平（P<0.05）,但不影响Akt Thr308的磷酸化（P>0.05）;随PP242处理时间增加,p-Akt Ser473的表达逐渐下调（P<0.05）,但p-Akt Thr308和p-eNOS Ser1177/1179未受明显影响（P>0.05）。三种细胞的检测结果一致。结论:Akt Thr308的磷酸化水平对p-eNOS Ser1177/1179的表达具有重要的调节作用。第二部分PDK1和SIN1基因敲减对eNOS激活的影响目的:蛋白激酶PDK1是磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K）/Akt/eNOS信号转导通路的上游激酶,可以通过磷酸化Akt的Thr308位点激活Akt;mTOR的复合体哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体2（mammalian target of rapamycin complex 2,mTORC2）可通过调控Akt Ser473位点的磷酸化而活化Akt,SINl是组成mTORC2的亚基之一。本部分主要观察敲低PDK1及SIN1对Akt及eNOS激活的影响。方法:构建PDK1和SIN1的小干扰RNA（small interferingRNA,siRNA）以及阴性对照（negative control,NC）分别转染eNOS-HEK293细胞,并将细胞分为以下4组:Control组、siRNA-PDK1组、siRNA-SIN1组和siRNA-NC组。Western blot检测PDK1和SIN1蛋白表达量以及Akt和eNOS的磷酸化水平。结果:（1）siRNA-PDK1和siRNA-SIN1显著抑制eNOS-HEK293细胞中PDK1和SIN1的蛋白表达水平（P<0.001）,siRNA-NC不影响上述蛋白的表达（P>0.05）。（2）与siRNA-NC组相比,敲低PDK1明显降低了Akt Thr308磷酸化水平（P<0.001）,而敲低SIN1则显著抑制了Ser473的磷酸化（P<0.001）。（3）与siRNA-NC组相比,敲低PDK1显著抑制eNOS Ser1177磷酸化的表达（P<0.001）,而敲低SIN1不影响其表达（P>0.05）;敲减PDK1或SIN1对p-eNOS Thr495的表达均无明显影响（P>0.05）。结论:我们用基因沉默的方法证明了Akt Thr308位点对p-eNOS Ser1177具有调控作用。第三部分Akt磷酸化对小鼠血管组织eNOS/NO稳态的影响目的:内皮源性舒张因子一氧化氮（nitric oxide,NO）在心血管系统中具有维持血管张力和调控血压的重要作用,血管内皮细胞中eNOS Ser1177位点的磷酸化水平对NO的合成具有至关重要的作用。Akt是PI3K/Akt/eNOS信号通路中催化NO合成的重要调节蛋白,本部分主要探讨小鼠动脉血管组织中Akt不同磷酸化位点对eNOS活化以及血浆中NO含量的影响。方法:将雄性C57BL/6J小鼠随机分为3组（每组4只）:正常对照组（DMSO组）、GSK2334470组（40 mg/kg）和PP242组（5 mg/kg）。给予小鼠一次性腹腔注射DMSO、GSK2334470和PP242,给药处理6h后,采集小鼠血液、胸主动脉和肠系膜动脉。Western blot检测小鼠动脉中Akt、eNOS及其磷酸化水平的表达量,酶联免疫吸附测定法检测小鼠血浆NO含量。结果:（1）与DMSO组相比,GSK2334470组小鼠动脉中Akt Thr308的磷酸化水平显著下调（P<0.01）,p-Akt Ser473的表达未受影响（P>0.05）;eNOS Ser1177的磷酸化水平也被抑制（P<0.01）。（2）与DMSO组相比,PP242显著抑制小鼠动脉组织中Akt Ser473的磷酸化水平（P<0.001）,但p-Akt Thr308及p-eNOS Ser1177的表达未受明显影响（P>0.05）。（3）与DMSO组相比,GSK2334470显著降低小鼠血浆中NO含量（P<0.05）;PP242对小鼠血浆NO含量无明显影响（P>0.05）。结论:抑制p-Akt Thr308显著抑制小鼠血管组织中p-eNOS Ser1177的表达和NO合成,Akt在Thr308位点的磷酸化水平与小鼠血管组织eNOS/NO稳态密切相关。第四部分低温刺激对Akt及eNOS磷酸化的影响目的:低温环境下,机体通过能量代谢维持体内稳态,作为一种重要的激酶,Akt在调控细胞能量代谢相关信号转导中发挥着重要作用。本部分主要研究不同环境温度对Akt磷酸化及下游eNOS在Ser1177位点磷酸化的影响。方法:体外培养eNOS-HEK293细胞、HUVECs和BAECs,分别对3种细胞进行不同温度处理（分别为37℃、22℃、4℃）,持续1 h。Western Blot检测上述细胞中Akt和eNOS磷酸化水平的变化。结果:（1）在eNOS-HEK293细胞中,p-Akt Ser473蛋白表达量随温度的降低而下调（P<0.01）,p-Akt Thr308和p-eNOS Ser1177未发生明显变化（P>0.05）。（2）原代血管内皮细胞（HUVECs和BAECs）中,p-Akt Ser473的表达随温度下降而降低（P<0.05）,但p-Akt Thr308的表达随着温度下降反而出现升高的趋势（P<0.05）,p-eNOS Ser1177/1179的表达趋势与p-Akt Thr308一致（P<0.01）。结论:在不同的环境温度下,Akt Thr308的磷酸化水平与p-eNOS Ser1177/1179的表达密切相关,p-Akt Thr308对血管内皮细胞eNOS激活具有重要调节作用。