【摘 要】
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实验目的:利用生物信息学数据库筛选预测出可能靶向调控铁死亡相关基因--胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白溶质载体家族7成员11（solute carrier family 7 member11,SLC7A11,x CT）的miRNA—miR-128-3p,采用肝癌HepG2细胞系诱导形成非酒精性脂肪肝细胞模型,验证筛选预测的miRNA对铁死亡的调控作用,及其通过铁死亡对HepG2非酒精性脂肪肝细胞模型的影
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实验目的:利用生物信息学数据库筛选预测出可能靶向调控铁死亡相关基因--胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白溶质载体家族7成员11（solute carrier family 7 member11,SLC7A11,x CT）的miRNA—miR-128-3p,采用肝癌HepG2细胞系诱导形成非酒精性脂肪肝细胞模型,验证筛选预测的miRNA对铁死亡的调控作用,及其通过铁死亡对HepG2非酒精性脂肪肝细胞模型的影响。阐明miR-128-3p通过铁死亡调节非酒精性脂肪肝病的机制。实验方法:实验室复苏培养人HepG2肝癌细胞系,培养3-5代后,在体外利用油酸钠诱导HepG2细胞,形成非酒精性脂肪肝细胞模型。利用生物信息学数据库筛选预测出可能靶向调控铁死亡相关基因SLC7A11的miRNA—miR-128-3p,在非酒精性脂肪肝细胞模型中用荧光定量PCR（quantitative real time polymerase chain reaction,q RT-PCR）方法检测该基因的表达水平。过表达和敲降该miRNA,检测表达量变化,检测铁死亡相关蛋白SLC7A11与谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4,GPx4）基因m RNA与蛋白表达水平。检测铁死亡可能在非酒精性脂肪肝体外细胞模型中起到的作用,通过检测与脂质合成分解相关基因脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase,FASN）、固醇调节元件结合蛋白-1C（sterol regulatory element-binding protein 1C,SREBP-1C）、过氧化物酶体增殖物活化受体α（peroxisome proliferator activated-receptorα,PPARα）蛋白表达变化。在非酒精性脂肪肝细胞模型中过表达和敲降预测目的基因,同时分别加入铁死亡诱导剂Erastin和铁死亡抑制剂Ferrostatin-1,检测铁死亡相关基因SLC7A11与GPx4的表达变化,同时检测活性氧的变化,检测脂质代谢相关基因FASN、SREBP1C、PPARα蛋白表达变化,检测脂质代谢基因FASN、SREBP1C、PPARα蛋白表达变化,通过油红染色检测HepG2细胞内脂肪堆积程度,进一步说明预测目的基因通过改变非酒精性脂肪肝模型中铁死亡的变化,及对脂肪代谢产生影响。实验结果:（1）生物信息学数据库筛选预测出miR-128-3p可能靶向调控铁死亡相关基因SLC7A11,在非酒精性脂肪肝模型中检测到miR-128-3p较对照组表达显著增加。（2）正常的HepG2细胞中过表达miR-128-3p可导致SLC7A11和GPx4表达显著降低,而敲降miR-128-3p则有相反的作用。（3）非酒精性脂肪肝模型中铁死亡显著升高;在非酒精性脂肪肝细胞模型中过表达miR-128-3p后发现模型中SLC7A11和GPx4较正常细胞表达显著下降,且与脂质合成相关蛋白FASN与SREBP-1C蛋白表达量显著上升而脂质代谢相关基因PPARα的蛋白表达量显著下降,细胞内脂肪堆积程度显著增多;敲降miR-128-3p,模型中SLC7A11和GPx4较正常细胞表达显著上升,FASN与SREBP-1C蛋白表达含量显著降低而PPARα蛋白表达含量显著上升,细胞内脂肪堆积程度显著降低,活性氧检测ROS水平均显著降低。（4）在非酒精性脂肪肝细胞模型中过表达或敲降miR-128-3p后添加Ferrostatin-1或Erastin,结果显示Ferrostatin-1会明显减弱由过表达miR-128-3p所诱导的铁死亡,使SLC7A11和GPx4表达显著升高,FASN与SREBP-1C蛋白表达含量显著降低而PPARα蛋白表达含量变化不显著,细胞内脂肪堆积程度显著降低;而添加Erastin则出现相反作用。实验结论:（1）非酒精性脂肪肝模型中铁死亡显著增强,并且过表达miR-128-3p后可以促进模型中铁死亡显著增强,敲降miR-128-3p则显著抑制模型中铁死亡。（2）铁死亡增强会使非酒精性脂肪肝细胞模型内脂滴显著增多,抑制铁死亡可使模型内脂滴显著减少,说明在非酒精性脂肪肝细胞模型中铁死亡与脂质代谢有紧密联系。（3）通过应用铁死亡特异性抑制剂Ferrostatin-1和诱导剂Erastin可以证明miR-128-3p对铁死亡的调控作用,以及铁死亡对非酒精性脂肪肝细胞模型的影响。
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