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目的肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)发生是多病因、多基因、多步骤的复杂过程,涉及癌基因或癌相关基因激活、抑癌基因失活及(或)胚胎期某些癌基因重新激活等诸多相关信号通路和基因调控。HCC预后极差,早期诊断与有效治疗极为重要。新近证实癌胚抗原磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(Glypican-3, GPC-3)表达与肝细胞恶性转化密切相关,对HCC诊断具较高特异性和敏感性,但它是否可成为肝癌基因治疗的有效靶点值得探讨。本研究旨在构建与筛选干扰GPC-3基因转录特异的短发夹型RNA(short hairpin RNA, shRNA)真核表达质粒；转染肝癌细胞观察对增殖、侵袭、细胞周期及周亡的影响,明确干预基因转录对Wnt/Hh相关通路调控和联合抗癌药物抑制癌细胞增殖的协同效果。方法按GPC-3基因序列合成4对干扰GPC-3-shRNA和1对阴性对照shRNA,插入pGPU6/GFP/Neo载体,构建真核表达质粒,转染肝癌HepG2、MHCC-97H和Huh7)细胞,筛选对GPC-3基因转录干扰特异的高效质粒,以荧光定量逆转录聚合酶链反应和Western blotting分析GPC-3、 β-catenin和Glil转录及蛋白表达；以MTT(3-(4,5-Dimethyl thiazol-2-yl)-2,(?)-diphenytetrazolium bromide)法分析HepG2细胞增殖,以EdU (5-ethynyl2’-deoxyuridine)嵌入和Hoechst33342染色法检测细胞增殖与凋亡；以划痕愈合、迁移运动及侵袭试验检测细胞增殖活力及迁移侵袭力；以磺酰罗丹明3(Sulforhodamine B, SRB)染色分析细胞活力；以酶联免疫吸附法定量细胞培养液中血管内皮生长因子(VEGF)表达；以流式细胞术、Annexin-V-PE/7-AAD及细胞凋亡-DNA ladder电泳等分析细胞周期与凋亡；以免疫荧光技术分析细胞β-catenin和IGF-II表达；以Caspase-Glo(?)3/7发光法检测细胞Caspase3和Caspase7活性。结果成功构建了4条pGPU6/GFP/Neo-GPC-3-shRNAl-4干扰质粒,分别转染至人肝癌(HepG2、MHCC-97H和Huh7)细胞株,转染效率均在80%以上；经筛选,shRNA1为最有效干扰质粒,分别转染三种肝癌细胞后,显著抑制GPC-3mRNA和蛋白表达,抑制HepG2细胞增殖,抑制率为71.1%(P<0.001),呈时间依赖性；且将细胞周期阻滞在G1期；并促进细胞凋亡,凋亡率达66.8%(t=-11.456,P=0.008)；干扰GPC-3表达后,显著抑制肝癌细胞的划痕愈合力、迁移运动力和侵袭力,下调Wnt信号通路β-catenin mRNA和蛋白表达,并上调Hh信号通路Glil mRNA和蛋白表达；免疫荧光证实肝癌细胞内β-catenin及IGF-Ⅱ表达明显下调；受转染HepG2细胞培养24h、48h和72h时,VEGF表达分别下调36.7%、46.2%和54.2%,并呈时间依赖性；在体外,靶向药物索拉非尼、雷帕霉素和厄洛替尼抑制肝癌细胞最有效IC50值,分别为4.67±1.20μM、7.85±2.00nM和18.38±0.56μM, shRNA1联合靶向化疗药物对肝癌细胞具协同作用,使Caspase3/7活性显著增加,癌细胞凋亡率为空白组3倍,但预处理Caspase泛抑制剂Z-VAD-FMK后,癌细胞凋亡率逆转,降至31.5%。结论下调GPC-3转录可通过促进凋亡机制显著抑制肝癌细胞增殖,减低肝癌细胞增殖、侵袭、迁移能力,通过Wnt和Hh信号通路抑制新血管生成,与抗癌药物具协同抑制作用,提示GPC-3可望成为肝癌基因治疗潜在的分子靶目标。