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人田鼠巴贝虫病是一种重要的人兽共患血液原虫病,其病原体为田鼠巴贝虫,该病主要通过蜱叮咬及输血传播。人体感染田鼠巴贝虫后的临床症状表现不一,轻者可为无症状感染者,重者可出现类似于疟疾发作症状,甚至危及生命,尤其是当病人为免疫缺陷者或年老者。目前,田鼠巴贝虫病的诊断依然是以显微镜检查作为金标准。然而显微镜检查的敏感性低,且田鼠巴贝虫与疟原虫形态相似,难以分辨,容易造成误诊和漏诊,延误治疗。因此,急需研发快速有效的田鼠巴贝虫病诊断方法,而诊断抗原的选择是制备免疫诊断试剂的关键,天然粗抗原或重组抗原是诊断抗原的主要来源。目的本研究旨在通过制备田鼠巴贝虫粗抗原并分析其抗原组分,筛选有效的抗原组分,并初步建立间接ELISA技术用于田鼠巴贝虫病诊断;通过截短表达国内外文献报道的田鼠巴贝虫分泌性抗原1(Babesia microti secreted antigen 1,BmSA1),降低重组BmSA1抗原与疟原虫感染血清的交叉反应,提高用于诊断田鼠巴贝虫病的特异性;通过预测并合成BmSA1的抗原表位肽,筛选有望用于田鼠巴贝虫病免疫诊断的抗原肽;通过用BmSA1免疫小鼠制备单克隆抗体,为后续建立以抗体检测循环抗原的免疫诊断技术奠定基础。方法1)用田鼠巴贝虫标准株(Babesia microti ATCC(?)PRA-99TM)感染BALB/c小鼠,待虫血症达高峰时,提取田鼠巴贝虫虫体并制备可溶性粗抗原,SDS-PAGE和Western Blot进一步分析有效抗原组分,初步建立以粗抗原为基础的间接ELISA技术。2)通过用DNA2.0软件对BmSA1基因进行密码子优化,原核表达BmSA1蛋白,并评价其与疟疾病人血清交叉反应率。3)截短表达N-末端及C-末端BmSA1,并比较其与疟原虫感染病人血清的交叉反应率。4)用DNASTAR、ABCPred、LEPS、VSMTrip四种软件预测BmSA1抗原表位,并合成抗原表位肽,用间接ELISA法鉴定其诊断效果。5)用全长BmSA1免疫小鼠,分离脾B细胞与骨髓瘤细胞融合,制备特异性单克隆抗体。结果1)建立了可溶性粗抗原-ELISA法,可检测感染早期(7d)小鼠血清,且与恶性疟、间日疟病人及弓形虫抗体阳性者血清无交叉反应,显示出其较好的诊断敏感性和较高的特异性。通过SDS-PAGE分析,获得5条分子质量约为72、66、60、53、43 kDa的主蛋白带和介于14.4～116kDa的7条次带。经Western Blot分析,SBA有15个抗原组分能被田鼠巴贝虫阳性小鼠血清识别,以分子量约为72、53、43、39、30 kDa蛋白组分反应较强。2)通过密码子优化,BmSA1蛋白获得了高效、可溶性表达,其与恶性疟原虫感染者血清的交叉反应为13.3%,与间日疟原虫感染者血清的交叉反应为26.7%。3) N-末端截短型BmS A1 (N-BmSA1)和C-末端截短型BmSA1 (C-BmSA1)均能与田鼠巴贝虫阳性血清反应,其中N-BmSA1与疟原虫阳性血清交叉反应率基本与全长BmSA1相同,而C-BmSA1与疟原虫阳性血清未检测出交叉反应。4)鉴定出氨基酸26-59、氨基酸239-256、氨基酸252-271、氨基酸272-287、氨基酸281-300为BmSA1的抗原表位,ELISA检测阳性小鼠血清和阴性小鼠血清的OD值比值均大于2.1,有较好的诊断应用价值。5)获得3株识别重组BmSA1和可溶性粗抗原的单克隆抗体细胞株。结论应用可溶性粗抗原建立的间接ELISA可作为田鼠巴贝虫感染的有效筛查工具;田鼠巴贝虫可溶性抗原组分中分子量约为72、53、43、39、30KDa的抗原组分有望成为诊断候选抗原,其特性和诊断效果有待进一步探讨。C-端截短型BmSA1相比全长BmSA1具有更高的诊断特异性,有望用于田鼠巴贝虫病的诊断。鉴定出的5个BmSA1抗原表位肽为后续建立抗原肽-ELISA试剂盒奠定了基础。