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研究背景:骨肉瘤（Osteosarcoma,OS）是是一种间叶性恶性肿瘤,其特征是肿瘤细胞形成未成熟的类骨质。它具有双峰分布,在10-20岁和65岁之后达到顶峰,是12至18岁儿童和青少年中第三常见的癌症类型,仅次于白血病和淋巴瘤[1]。83%骨肉瘤患者为高度恶性,侵袭性生长和快速血道播散早期出现肺转移是其特点,发病与长骨干第二生长高峰期密切相关[2]。20世纪70年代之前骨肉瘤的标准治疗方案为截肢手术,但术后5年生存率不足20%,随着化疗药物应用于骨肉瘤的治疗方案,OS患者的5年生存率较过去有显著进步,但伴有肺转移患者5年生存率仍不足30%[3-5]。40多年过去了,尽管临床肿瘤学飞速发展,抗肿瘤新药物出现层出不穷,但都没有新药能撼动骨肉瘤4个一线治疗药物的地位。但化疗药物治疗具有多药耐药性（multidrug resistance MDR）,一线化疗药物治疗失败的骨肉瘤患者后续有效药物极为缺乏,只能通过临床试验尝试新的治疗方案,因此,不断探索新的有治疗前景的药物是骨肉瘤临床治疗的当务之急[6]。我们筛选了两种中药单体,研究其对骨肉瘤的抑制作用:臭椿（Ailantus Altissima）是西马鲁巴科（Simaroubaceae）臭椿属（Ailantus）的一种植物。作为一种传统中药,它在中国有着悠久的历史[7];例如,它的树皮、根皮和果实曾被用来治疗蛔虫、腹泻、遗精、出血和胃肠道疾病。臭椿酮（Ailanthone,AIL）是从香椿中提取的一种五环二萜内酯类化合物。它在治疗炎症[8]、疟疾[9]、过敏[10]、肺结核[11]、溃疡[12]、和阿米巴相关疾病[13]方面有显著的临床疗效,并具有抗肿瘤作用。大量体外研究表明,AIL对多种肿瘤细胞有抑制作用,如急性髓系白血病[14]、膀胱癌[15]、肺癌[16]、胃癌[17]、肝癌[18]和乳腺癌[7]、前庭神经鞘瘤[19]和前列腺癌[20]。姜黄素（curcumin）是从姜科植物黄姜和天南星科中药的根茎中提取的一种相对分子质量小的疏水多酚类物质。随着对姜黄素研究的不断深入,姜黄素的抗炎[21]、抗氧化[22]、控制糖尿病[23]、调节细胞凋亡和增殖等多种活性作用陆续被发现,因其毒性低、不良反应小等优点,已在肝纤维化、动脉粥样硬化及肿瘤的治疗中显示出潜在的临床应用价值。既往研究显示姜黄素通过抑制多种信号传导途径,抑制上皮来源肿瘤如乳腺癌[24]、结肠癌[25]、胃癌[26]、前列腺癌[27]、黑色素瘤[27]等肿瘤细胞的增殖,调节自噬,诱导凋亡,抑制肿瘤细胞上皮间质转化从而降低肿瘤细胞迁移能力。研究目的1.探究不同浓度臭椿酮对人骨肉瘤细胞增殖活性、凋亡、迁移能力、侵袭性等方面的影响。2.通过转录组、蛋白质组学和代谢组学联合分析后,探究AIL对骨肉瘤细胞代谢的影响。3.探究不同浓度姜黄素对人骨肉瘤细胞增殖活性、凋亡、迁移能力、侵袭性等方面的影响。研究方法:第一部分:1.通过CCK-8、细胞划痕实验、Transwell以及细胞流式凋亡实验探究不同浓度臭椿酮理24 h后对骨肉瘤细胞的增殖活性、迁移、侵袭以及凋亡的影响。2.通过流式细胞术结合PI染色评估不同浓度臭椿酮处理24 h对骨肉瘤细胞周期分布的影响。3.通过检测代谢组学和蛋白组学筛选臭椿酮IC50浓度下处理24 h的代谢差异和蛋白差异。4.通过q RT-PCR和Western blot检测不同浓度臭椿酮处理24 h后造成的基因及蛋白差异。5.通过小鼠异种移植实验检测臭椿酮对骨肉瘤的体内成瘤的抑制作用。第二部分:1.通过CCK-8实验、细胞划痕实验、克隆形成实验、Transwell以及细胞流式凋亡实验探究不同浓度姜黄素处理24 h对骨肉瘤细胞的增殖活性、迁移、侵袭以及凋亡的影响。2.通过Western blot实验评估不同浓度的姜黄素处理24 h对骨肉瘤细胞凋亡蛋白表达影响。研究结果:第一部分:1.不同浓度臭椿酮处理24 h在体外可抑制OS细胞的增殖、迁移和侵袭且呈浓度依赖性。2.臭椿酮抑制OS皮下移植瘤生长3.不同浓度臭椿酮处理24 h诱导OS细胞凋亡和细胞周期阻滞,且呈浓度依赖性。4.蛋白组学结果分析显示68.6%的差异蛋白都与代谢过程相关,其中丝氨酸生物合成通路变化最显著。5.q RT-PCR和Western blot结果可降低丝氨酸合成通路（serine biosynthetic pathway,SSP）的表达与基于RNA-Seq的基因表达一致,AIL处理后两种细胞的PHGDH、PSAT1和PSPH m RNA均显著下调,并呈浓度依赖性。6.AIL治疗导致SSP及其下游通路的中间代谢物减少。7.过量表达PHGDH可以逆转AIL对OS细胞的影响。第二部分:1.姜黄素抑制骨肉瘤细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭以及诱导细胞凋亡,且呈浓度依赖性。2.Western blot检测姜黄素处理24 h后Cleaved-Caspase-3、BAX、BCL-2,得到结果为Cleaved-Caspase-3和BAX的表达明显增加,而BCL-2的表达明显降低。研究结论1.臭椿酮能够有效抑制骨肉瘤细胞的增殖、克隆、侵袭、迁移,诱导凋亡,通过丝氨酸合成途径下调PHGDH、PSAT1和PSPH以及叶酸的单碳库、嘌呤代谢、嘧啶代谢、DNA复制和鞘磷脂代谢,因此臭椿酮主要是通过介导代谢重编程发挥抗肿瘤作用。2.姜黄素能有效抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭,并诱导细胞凋亡。图12表2参141