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脱支酶（Debranching enzymes,DBEs）是一类能特异性水解支链淀粉及相关多糖中α-1,6-糖苷键的水解酶。在淀粉加工过程中,DBEs有效水解淀粉底物中的α-1,6-糖苷键,与其他淀粉酶协同作用可显著提高淀粉的转化率,降低生产成本。DBEs已被广泛应用于生产葡萄糖、麦芽糖、环糊精及抗性淀粉等产品。普鲁兰酶和异淀粉酶是目前研究最多的DBEs,两者具有不同的底物特异性。普鲁兰酶的底物特异性较弱,其既可以水解普鲁兰多糖又可以水解支链淀粉,且对支链淀粉中不同的链长没有明显的特异性;异淀粉酶则具有较强的底物特异性,其不能水解普鲁兰多糖,倾向于水解支链淀粉中的长支链,而且对中短长度支链的水解能力较弱。在不同淀粉糖生产中,可能需要添加不同底物特异性的DBEs,以显著提高糖化效率。因此,本课题旨在开发一种能特异性水解中短长度支链的新型脱支酶,即糊精脱支酶（Dextrin debranching enzyme,DDE,EC 3.2.1.33）,实现其在大肠杆菌中的分泌表达,并研究其酶学特性和晶体结构,以期为该酶的工业化应用打下坚实的基础。主要研究内容和结果如下:首先,以来源于Thermococccus gammatolerans的DDE为研究对象,利用生物信息学工具预测了DDE的基本理化性质,为接下来的构建表达提供理论基础。研究结果表明,DDE的分子量为68621.63 Da,等电点为6.35,该酶氨基酸序列中的亲水性氨基酸数量偏多,表现为一定的亲水性,且不存在跨膜结构域。DDE的二级结构与三级结构预测结果显示,其结构以α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲为主。其次,实现了DDE在大肠杆菌中的分泌表达,并对基因工程菌的摇瓶发酵条件进行了优化。将目的基因插入载体,分别构建了表达载体p ET-15b（+）/dde、p ET-28a（+）/dde和p ET-20b（+）/dde,将它们转化至宿主Escherichia coli BL21（DE3）,获得了基因工程菌。通过对基因工程菌E.coli BL21（DE3）（p ET-20b（+）/dde）的发酵条件进行优化,促进了DDE的可溶性表达。研究结果表明,发酵培养基为TB培养基,诱导温度为25℃,诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷浓度为0.01 m M（v/v）更适合重组酶的分泌表达,在该条件下诱导发酵84 h,酶活力达到326.0 U/m L,比优化前的酶活力提高了121.8%。然后,采用镍柱亲和层析对DDE进行纯化,并表征了酶学性质。研究结果表明,DDE的比活力为733.3 U/mg,最适温度为70°C,最适p H为4.0,70℃孵育90 min,酶活力保持在50%以上;在p H 3.5～5.0缓冲液中4°C孵育3 h,酶活力仍保持在80%以上,具有良好的热稳定性和耐酸性。DDE对金属离子具有一定的依赖性,Pb2+、Ba2+对酶活力有显著的激活作用,分别提高了91%和116%;Fe3+和Co2+完全抑制了DDE的活力。选择不同底物进行脱支反应,发现DDE对葡萄糖当量（Dextrose equivalent,DE）值为6的麦芽糊精表现出最高的水解活力,相对活力表现为:麦芽糊精＞糖原＞淀粉。因此,DDE显示出较高的底物特异性,即倾向于水解低分子量的麦芽糊精,但对分子量较大的淀粉和糖原水解作用较低。随后,深入探究了DDE对不同支链结构底物的作用方式,并比较了该酶与普鲁兰酶和异淀粉酶在底物选择性上的差异。使用凝胶渗透色谱分析脱支产物的分子量,发现DDE可将DE6麦芽糊精中大部分聚合态支链淀粉水解成小分子线性葡聚糖,该酶难以水解淀粉中的聚合态支链淀粉。DDE处理DE6麦芽糊精6 h的脱支率为80%,而该酶对蜡质玉米淀粉和木薯淀粉的脱支效果较差,脱支率分别为24%和30%。使用离子色谱分析脱支产物的链长分布,发现DDE具有较强的底物选择性,其对聚合度（Degree of polymerization,DP）13～24中短长度的支链具有较强的亲和力。DDE的最适脱支链长为DP13～24,其比普鲁兰酶的脱支链长范围（DP＞12）更集中,比异淀粉酶的脱支链长范围（DP＞25）更短。最后,解析了DDE的晶体结构,并通过分子对接模拟了酶与底物的结合方式。经过对结晶试剂盒初筛条件的优化,获得了可用于X-射线衍射的高质量蛋白结晶。将收集的衍射数据进行分子置换,成功解析了DDE的三维结构,分辨率为2.51?,PDB登记号为7VMA。DDE的催化结构域呈现（α/α）6桶状结构,经多序列比对和结构重叠分析发现,Asp241、Asp366残基和周围的残基形成一个可以容纳底物的活性口袋,推测Asp241和Asp366残基可能是酶活性中心处的催化残基。为进一步探究酶与底物结合的方式,采用分子对接模拟了DDE与麦芽七糖共结晶的三维结构,通过分析DDE中Arg112、Met116、Gly357和Ile358残基于麦芽七糖的氢键作用力,阐述了酶与底物稳定的结合方式,对进一步了解该酶的构效关系具有重要意义。