代谢工程是一种有目的、理性的修饰技术,它可以对细胞内酶催化的化学反应进行遗传操作,从而产生所需的分子。在代谢工程优化过程中,如何调节菌体生长与目标产物生产之间的平衡是需要解决的关键问题。酶的组成型的过表达会对宿主菌造成巨大的代谢负担,如果能实现相关基因的时序表达,就可以合理调控前体物质积累与目标产物生产之间的平衡。而动态调控相关基因的时序表达,不仅可以实现细胞代谢流的动态调控,还可以实现细胞内资源的合理配置,是解决上述问题的有效策略。使用诱导型启动子使细胞的生长过程和产物生产过程分开,可以实现对相关基因表达的调控,但这种方法不仅需要添加成本高的诱导剂,且不能实现对基因的动态调控以及时序表达;通过设计某种特定代谢产物诱导的生物传感器,虽然可以实现动态调控相关基因的表达,但是其通用性差,且不能实现基因的时序表达;群体感应（Quorum sensing,QS）可以通过感应细胞的密度变化从而实现对相关基因表达的调控,这种利用群体感应系统进行动态调控的方法,虽然通用性较好,但无法实现多个基因的时序表达;自然界原核生物中有一种双调控蛋白级联线路可以实现多个基因的时序表达,但仍然需要加入诱导剂,不利于大规模生产。综上,可以看出构建一个既不需要诱导剂,又通用性强的动态调控多个基因时序表达的元件十分必要。本文第一部分构建了基于群体感应的自诱导双调控蛋白级联线路。首先选择了两组启动子正交,信号串扰的群体感应系统（1.来自铜绿假单胞菌的Las系统与来自根瘤土壤杆菌的Tra系统,2.来自费氏弧菌的Lux系统与来自根瘤土壤杆菌的Tra系统）。然后以这两组群体感应系统为基础,构建了需要外源添加HSL小分子诱导剂诱导表达的双调控蛋白级联线路,根据实验结果选定HSL合成酶基因,进一步构建自诱导双调控蛋白级联线路。研究显示在基于Las,Tra系统的自诱导双调控蛋白级联线路菌株CTLas02中,标准化GFP荧光强度/OD600与标准化RFP荧光强度/OD600的响应时间差值约为120min;在基于Lux,Tra系统的自诱导双调控蛋白级联线路菌株CTLux02中,由于Lux系统对于3-oxo-C6-HSL（3OC6）的感应强度较弱,故在目前状况下RFP只得到了很弱的表达,但其响应时间差值也约为120min。以上结果说明本实验中所构建的基于群体感应的自诱导双调控蛋白级联线路均具有动态调控基因时序表达的特性,能够克服以往研究中的所有缺点,实现多个基因的动态、自诱导时序表达。本文进一步引入CRISPRi系统,将CRISPRi与基于群体感应的自诱导双调控蛋白级联线路结合应用在PHB的生产过程中。发酵结果显示,CRISPRi与基于群体感应的自诱导双调控蛋白级联线路结合的菌株PHB05,最终的PHB含量达到了 82.36%,而对照组菌株PHB01最终的PHB含量只有68.09%,与PHB01相比PHB05的PHB含量提高了 20.96%。而且从葡萄糖的消耗量来看,菌株PHB05的葡萄糖消耗量只是菌株PHB01葡萄糖消耗量的54.6%,所以菌株PHB05在同等条件下更节约成本。综合看,引入与CRISPRi结合的自诱导双调控蛋白级联线路的菌株PHB05不仅可以提高PHB含量,又可以节约成本,所以本研究中设计的基于群体感应的自诱导双调控蛋白级联线路在代谢工程中具有很好的应用前景。本文最后一部分旨在通过定向进化群体感应调控蛋白的方法,设计构建一系列时序和表达强度不同的自诱导双调控蛋白级联线路。定向进化TraR的结果显示,与对照组菌株CTLas02的标准化GFP荧光强度/OD600与标准化RFP荧光强度/OD600的响应时间相比,菌株T10,T20,T24的GFP、RFP的响应时间均向后延迟20min,菌株T22只有GFP的响应时间向后延迟20min,通过定向进化TraR的方法,共得到4株含有时序和表达强度不同的自诱导双调控蛋白级联线路的菌株。而在进一步的研究中可以通过增加突变体文库的量,直接找到群体感应调控蛋白的功能区采用半理性设计定向进化等手段,完善设计构建的方法,获得更多时序和表达强度不同的自诱导双调控蛋白级联线路,为代谢应用提供更多可选择的合成生物学通用元件。本研究基于群体感应系统构建得到了两组可以实现动态调控多个基因时序表达的自诱导双调控蛋白级联线路,将该线路应用在PHB生产过程实现了 PHB含量的提高。该线路可以作为合成生物学的通用元件,不仅为基因动态时序调控提供了新的研究思路和理论基础,也为解决代谢工程研究中的瓶颈问题提供了新的方法。