第一部分 高硬脂酸饮食通过肠道菌群影响小鼠急性移植物抗宿主病目的研究高硬脂酸饮食（High stearic acid diet,HSAD）与高软脂酸饮食（High palmitic acid diet,HPAD）对小鼠allo-HSCT后aGVHD的影响,并明确肠道菌群是否参与HSAD诱导的小鼠严重aGVHD。方法我们首先采用MHC完全不合的C57BL/6小鼠→BALB/c小鼠进行异基因骨髓移植（allogeneic bone marrow transplantation,allo-BMT）后发生 aGVHD 的小鼠模型来探究HSAD与HPAD对小鼠aGVHD的影响。我们在移植前4周起对BALB/c（H-2d）受体小鼠进行HSAD或HPAD饲料喂养,采用正常饲料（Normal diet,ND）组小鼠作为对照。在allo-BMT第0天,受体小鼠接受致死性剂量X-ray照射（650 cGy）后输注野生型C57BL/6（H-2b）供体来源的混合淋巴细胞,单纯输注骨髓来源细胞（BM only）作为无aGVHD对照组。移植后监测受体小鼠aGVHD的生存以及一般情况,在移植后第7天留取皮肤、肝脏、肺、小肠以及结肠进行病理检测,评估aGVHD靶器官病理损伤程度。通过筛选我们发现只有HSAD可以显著加剧小鼠aGVHD。通过在移植前不同时间点起开始HSAD干预以及结合干预不同时间的血清血脂水平改变评估HSAD干预时间对aGVHD的影响,建立稳定的HSAD干预的aGVHD模型。进一步通过非经典型移植模型（BALB/C→C57BL/6）改变受体遗传背景,对C57BL/6供体小鼠进行HSAD干预,以及采用超长链脂肪酸延伸酶6（ELOVL6）抑制剂抑制小鼠体内硬脂酸的合成进行反向验证,明确HSAD干预对小鼠aGVHD的影响。最后,我们通过观察联合广谱抗生素清除肠道菌群以及实施粪菌移植（FMT）对ND小鼠和HSAD小鼠aGVHD的影响,验证肠道菌群是否参与了小鼠aGVHD发生发展。结果（1）与单纯移植C57BL/6供体小鼠骨髓细胞的BM only组相比,接受C57BL/6供体小鼠来源的骨髓细胞联合脾细胞移植物的allo-BMT组发生了 aGVHD。（2）高软脂酸饮食（HPAD）对小鼠aGVHD没有影响,而高硬脂酸饮食（HSAD）干预显著加重小鼠aGVHD,受体小鼠的生存时间明显缩短,aGVHD的临床症状以及靶组织损伤也更为严重。（3）Allo-BMT前3周起开始HSAD干预就可以加重aGVHD相关死亡,移植前4周起开始HSAD干预表现出最严重的aGVHD。并且HSAD连续干预4周可以显著影响小鼠血清血脂指标,包括总胆固醇（T-CHO）、高密度脂蛋白（HDL-c）以及低密度脂蛋白（LDL-c）,而对甘油三酯（TG）含量无明显影响。（4）在非经典的BALB/c→C57BL/6移植模型中,接受HSAD的受体小鼠依然表现出严重aGVHD。（5）接受来自正常饮食与接受来自HSAD干预的野生型C57BL/6供体小鼠来源的移植物的BALB/c受体小鼠之间的aGVHD的生存时间、体重改变以及临床表现无明显差异。（6）通过ELOVL6抑制剂抑制小鼠体内硬脂酸的合成,可以显著延长HSAD诱导的aGVHD的发生发展。（7）ND组和HSAD组小鼠中,与未接受联合广谱抗生素（Abx）清除肠道菌群的小鼠相比,Abx组小鼠的生存均明显改善,并且在HSAD组中作用更加显著,但是否应用抗生素对各组之间的aGVHD临床评分无明显影响。（8）与未接受粪菌移植的HSAD对照组相比,移植ND组小鼠粪便菌群后的HSAD组生存时间明显延长,而移植HSAD组粪便菌群后的ND组小鼠的生存率无明显变化。结论（1）高软脂酸饮食（HPAD）对小鼠aGVHD没有影响,而高硬脂酸饮食（HSAD）引起了小鼠严重aGVHD,表现为生存时间明显缩短,临床症状以及靶组织损伤明显加重。（2）移植前4周起开始补充硬脂酸,不仅可以对小鼠血脂水平（T-CHO、HDL-c以及LDL-c）产生明显影响,也可以诱导严重aGVHD的发生,是进行硬脂酸干预aGVHD研究的一个稳定的动物模型。（3）HSAD对小鼠aGVHD的促进作用与遗传背景无关,受体小鼠接受HSAD可以引起严重aGVHD,抑制硬脂酸的合成可以改善HSAD诱导的严重aGVHD。（4）HSAD组受体小鼠接受抗生素清除肠道菌群以及接受ND组小鼠的粪便悬液进行粪菌移植均可以改善HSAD组小鼠aGVHD的严重程度。（5）高硬脂酸饮食（HSAD）通过肠道菌群影响小鼠aGVHD。第二部分 高硬脂酸饮食通过促进小鼠Th1以及Th17细胞发挥加重aGVHD的作用目的观察HSAD及ND小鼠在异基因骨髓移植后免疫细胞的改变,寻找HSAD对小鼠T淋巴细胞免疫应答的改变以及分泌细胞因子的影响,并进一步探究独立的细胞因子在HSAD诱导的严重aGVHD中的作用,明确HSAD调节aGVHD的机制。方法我们采用第一部分建立起来的高硬脂酸饮食干预的严重aGVHD的稳定小鼠模型,首先采用流式细胞术检测ND以及HSAD受体小鼠在allo-BMT后第7天脾脏细胞中异基因活化的T细胞反应以及其效应和记忆功能。进而通过分选试剂盒分别构建供体去除CD4+T细胞以及去除CD8+T细胞的移植模型进行体内验证,观察HSAD受体小鼠接受供体来源的去除CD4+T细胞的脾细胞（Depletion of CD4+cells HSAD）或者去除 CD8+T 细胞的脾细胞（Depletion of CD8+cells HSAD）对 aGVHD的影响。接着采用LegendPlex多因子定量分析法检测HSAD以及ND小鼠在移植后第6天的血清中辅助性T细胞分泌的常见的13种细胞因子的表达水平,包括:IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22、IFN-γ 和 TNF-α,筛选HSAD引起的血清炎症因子变化。接着我们通过流式细胞术检测allo-BMT后第7天体内脾脏细胞中CD4+T淋巴细胞分化和产生的细胞因子,包括Treg、IL-2、TNF-α、IFN-γ+Th1细胞以及IL-17A+Th17细胞的表达,并通过研究抗生素干预后相应免疫细胞的变化,进一步明确HSAD在aGVHD中的作用及其对T细胞的影响。最后,我们分别采用 RORγt-/-（H-2b）、IL-17A-/-（H-2b）、IL-17F-/-（H-2b）以及 IFN-γ—/-（H-2b）小鼠作为移植供体,野生型（WT）C57BL/6（H-2b）小鼠作为供体对照,ND以及HSAD组BALB/c（H-2d）小鼠作为受体,进行allo-BMT,评估上述细胞因子是否单独可以影响HSAD引起的aGVHD的严重程度,明确HSAD诱导严重aGVHD的免疫机制。结果（1）与ND组小鼠相比,HSAD组小鼠CD4+CD69+活化的T细胞的比例以及数量均明显增多,CD4+的效应T细胞（CD44+CD62L-）以及记忆T细胞（CD44+CD62L+）的比例和数量在HSAD组明显升高,而CD8+T细胞的活化、效应以及记忆功能在两组间无明显差异。（2）与对照组HSAD小鼠相比,供体来源的移植物去除CD8+T细胞并不能改善HSAD小鼠的生存,而供体来源的移植物去除CD4+T细胞明显延长了 HSAD小鼠的生存时间,并且该组小鼠的生存时间与ND组小鼠无统计学差异,其aGVHD临床症状也明显改善。（3）与ND组小鼠相比,HSAD小鼠血清中IFN-γ、IL-17A、IL-17F和IL-5水平显著升高,而 IL-2、IL-4、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-21、IL-22 和 TNF-α水平在两组小鼠间无显著差异。（4）与ND组小鼠相比,HSAD小鼠中CD4+T细胞分泌的TNF-α和IL-2的比例以及数量均无明显差异,而其IFN-γ+Th1细胞以及IL-17A+Th17细胞显著增加,抗生素干预后能明显抑制脾脏中CD4+T细胞分泌的IFN-y+Th1细胞以及IL-17A+Th17细胞。（5）与输注WT来源移植物的HSAD小鼠相比,输注了 RORγt-/-、IL-17F-/-以及IFN-γ-/-来源移植物的HSAD受体小鼠的生存时间显著延长。（6）与输注WT来源移植物的HSAD小鼠相比,输注了 IL-17A-/-来源移植物的HSAD受体小鼠的生存情况无明显改善。结论（1）HSAD显著促进了小鼠CD4+T细胞的活化、效应以及记忆功能,HSAD发挥促进aGVHD的作用主要是由CD4+T细胞介导的。（2）HSAD通过促进IFN-γ+Th1细胞以及IL-17A+Th17细胞的数量及其分泌的细胞因子（IL-17F和IFN-y）显著加剧了小鼠aGVHD。（3）接受RORγt-/-、IL-17F-/-以及IFN-γ-/-供体来源的移植物可以显著改善HS AD诱导的严重aGVHD,但IL-17A对该过程无明显作用。第三部分 高硬脂酸饮食通过增加肠道AKK菌促进小鼠aGVHD的体内机制研究目的研究高硬脂酸饮食（HSAD）和正常饮食（ND）对小鼠肠道微生态的影响以及寻找两组中改变最明显的肠道微生物,并采用标准菌株探讨单一菌种对aGVHD的影响及其作用机制。方法收集HSAD以及ND小鼠饮食干预第28天时的粪便样本,首先提取粪便DNA通过16S rDNA高通量测序技术分析不同饮食组小鼠的肠道菌群的Alpha多样性和Beta多样性,采用LEfSe分析筛选两组在丰度上有显著差异性的菌种。筛选出差异细菌后,我们在移植前4周起给予HSAD组小鼠灌服ND组小鼠中明显上调的细菌标准菌株,给予ND组小鼠灌服HSAD组小鼠中明显上调的细菌标准菌株,以灌服等体积PBS作为对照,在此基础上进行allo-BMT,观察移植后各组小鼠aGVHD的生存以及一般状态,并进一步通过流式细胞术检测移植后aGVHD的靶器官脾脏中IFN-γ+Th1细胞以及IL-17A+Th17细胞的表达。结果（1）HSAD组与ND组小鼠肠道菌群所含的物种总数无明显差异,但ND组的细菌数量明显低于HSAD组。（2）Beta多样性显示两组小鼠的肠道菌群结构具有显著差异。（3）LEfSe物种差异分析结果显示HSAD组中Akkermansia（阿克曼菌属,AKK菌）显著增加,ND组中含量最多的为Bacteroides（拟杆菌属）。（4）补充AKK菌标准菌株（A.muciniphila）显著促进了 ND小鼠aGVHD的严重程度,而补充脆弱拟杆菌标准菌株（B.fragilis）并未改善HSAD小鼠的严重aGVHD。粪便qRT-PCR的结果提示AKK菌容易定殖于小鼠肠道,相反地,脆弱拟杆菌不易定殖。（5）与ND组小鼠相比,HSAD小鼠CD4+T细胞中IFN-γ+Th1细胞和IL-17A+Th17细胞显著增加,并且补充了 AKK菌的ND小鼠（ND+A.muciniphila）中IFN-γ+Th1细胞和IL-17A+Th17细胞显著增加,而HSAD小鼠与ND+A.muciniphila 小鼠中这两种细胞的比例无明显差异。结论（1）HSAD通过引起小鼠明显的肠道菌群紊乱,进而促进严重aGVHD的发生。（2）HSAD组中明显升高的AKK菌可以诱导小鼠严重aGVHD的发生,并且这种作用是通过促进IFN-γ+Th1细胞和IL-17A+Th17细胞实现的。（3）肠道微生态的改变为深入研究HSAD引起的小鼠严重aGVHD的发病机制提供了新的思路。第四部分AKK菌通过产生短链脂肪酸促进Th1以及Th17细胞加剧小鼠aGVHD的体外机制研究目的探讨高硬脂酸饮食（HSAD）和正常饮食（ND）对小鼠粪便代谢轮廓的影响,通过关联分析筛选HSAD组小鼠中明显上调的AKK菌的代谢产物。观察体外硬脂酸（SA）对AKK菌生长的作用,并探讨体外条件下AKK菌对Th1以及Th17细胞的作用及其作用机制。方法采用基于气相色谱-质谱（GC-MS）联用的代谢组学技术对粪便的代谢产物进行非靶向测定,分析研究两组小鼠的粪便代谢轮廓,通过Spearman相关性分析研究特定菌种与代谢物之间的相关性。在AKK菌的体外研究中,我们首先采用不同浓度的硬脂酸（0mM、0.1mM以及1mM）直接刺激AKK菌的标准菌株,观察其生长情况。进一步分离AKK菌的不同提取物,包括细菌培养上清（extracellularsecretions,ES）、细菌悬液（suspension,SUS）以及无细胞提取物（cell-free extracts,CFE）,以无细菌对照组（no-bacterial vehicle,con）作为对照,与不同浓度的硬脂酸（0mM、0.1mM以及1mM）一起与Naive CD4+T细胞共培养,并刺激其向Th1以及Th17细胞方向分化,观察不同处理组Th1以及Th17细胞的表达。利用GC-MS对AKK菌培养上清中的7种短链脂肪酸（包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、异戊酸和异丁酸）进行靶向检测分析。最终采用不同浓度乙酸（Aceticacid）、丙酸（Propanoicacid）和丁酸（Butyricacid）与Naive CD4+T细胞共培养,并刺激其向Th1以及Th17细胞方向分化,观察不同浓度的乙酸、丙酸和丁酸对Th1以及Th17细胞的影响。结果（1）ND组和HSAD组小鼠的粪便代谢轮廓具有显著差异,共鉴定出3 1种差异代谢物,包括核苷类衍生物、氨基酸、有机酸、脂肪酸、碳水化合物等（均VIP值＞1且P＜0.05）。（2）与Akkermansia显著正相关的粪便代谢物有17个,按相关性从大到小排序依次为:丙酸、丙酸-1、3-羟基丁酸、乙酸、丁酸、苯乙酸、色氨酸、软脂酸、硬脂酸、硬脂酸-1、异亮氨酸-1、脯氨酸-1、2-酮丁酸、乙酸-1、软脂酸-1、氨基乙磺酸与磷酸,其中排在前6位的均属于短链脂肪酸类。与Bacteroides显著正相关的代谢物有5个,按相关性从大到小排序依次为:核糖、葡糖酸、嘧啶-1、鼠李糖-1以及阿拉伯糖。这些差异代谢物均满足相关系数r＞0.6且差异具有统计学意义（P＜0.05）。（3）硬脂酸在体外可以显著促进AKK菌生长,AKK菌培养上清可以显著促进IFN-γ+Th1细胞和IL-17A+Th17细胞的表达。（4）AKK菌培养上清中可以检测出7种短链脂肪酸,所有样本中乙酸含量最高,约占96%左右,其次为丙酸和丁酸（合计约占2%左右）,其余4种短链脂肪酸（戊酸、己酸、异丁酸和异戊酸）的含量极低,合计约占不到1%。随着与Naive CD4+T细胞共培养的乙酸、丙酸和丁酸浓度的增大,细胞培养上清中IFN-γ+Th1细胞和IL-17A+Th17细胞的比例逐渐增加。结论（1）与ND组小鼠相比,HSAD组小鼠具有更加显著的粪便代谢轮廓改变。（2）在体外条件下,硬脂酸可以直接刺激AKK菌的生长,AKK菌可以通过短链脂肪酸（主要是乙酸、丙酸和丁酸）促进Th17和Th1细胞。