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目的：转移是90%的肿瘤病人死亡的原因。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)发生于肿瘤转移早期,是肿瘤获得转移能力的重要步骤。因此探寻EMT过程中关键作用分子,并针对其开发靶向治疗手段,可能有利于及肿瘤转移的早期干预,成为抗转移治疗的策略。文献报道,MDM2表达水平和肿瘤转移密切相关,然而其在EMT过程中发挥的作用和机制却尚未阐明。本课题在观察MDM2于卵巢囊腺癌中表达情况的基础上,通过进一步探讨其在EMT过程中扮演的角色,以期发现其新的生物学功能及潜在抗肿瘤转移治疗作用靶点。方法：(1)结合免疫组化法和统计学方法来分析临床卵巢囊腺癌组织中MDM2的表达水平及相关的临床意义；(2)运用质粒转染技术在卵巢癌SKOV3细胞中过表达MDM2蛋白,观察细胞形态变化并采用划痕修复和transwell进一步分析MDM2的表达对细胞运动能力的影响；(3)采用western blot和免疫荧光技术分析MDM2高表达对E-cadherin蛋白表达水平的影响；(4)通过western blot和real-timePCR技术分析MDM2高表达时E-cadherin的转录水平及Snail、Slug的蛋白和转录表达水平；(5)运用western blot、免疫荧光和双荧光素酶报告系统检测MDM2高表达时Smad信号通路激活情况,并通过siRNA转染技术沉默Smad2、Smad3和Smad4的表达,观察过表达MDM2诱导EMT的情况；(6)运用siRNA转染技术沉默MDM2表达对TGF-β诱导EMT及细胞迁移产生的干预作用；(7)运用western blot、real-time PCR和双荧光素酶报告系统检测沉默MDM2表达对TGF-β激活Smad信号通路作用的影响；(8)采用western blot、流式细胞术和transwell技术观察Nutlin-3对EMT及细胞迁移的干预作用。结果：1.临床卵巢囊腺癌中存在MDM2的高表达且具有临床意义选取123例临床卵巢囊腺癌(104例)及正常卵巢组织组织样本(19例),并采用免疫组化分析观察MDM2的表达情况。结果显示,大部分卵巢囊腺癌组织样本的细胞核、细胞浆中均能观察到不同程度的阳性着色,而MDM2在正常卵巢组织中的表达则呈阴性；人工计数分析结果也进一步表明,MDM2在正常组织中均为低表达,在卵巢癌组织中仅有6%的样本为低表达；图像分析结果发现卵巢癌组织中的阳性着色程度高于正常卵巢组织,且具有显著性差异；采用χ2检验来进一步分析MDM2在卵巢癌组织中高表达的临床意义,结果表明MDM2的表达水平与肿瘤的临床分期相关。2.MDM2诱导细胞运动的能力与其促EMT活性有关采用质粒转染技术,在卵巢细胞SKOV3中过表达MDM2蛋白,发现细胞形态发生明显转变；划痕修复和transwell结果均表明MDM2能够促使细胞发生迁移；Western blot和免疫荧光结果显示,MDM2高表达时能够促使E-cadherin的蛋白水平发生下调,说明MDM2能诱导EMT发生；通过进一步检测发现,MDM2能够通过上调Slug和Snail的蛋白表达从而抑制E-cadherin的转录。3.MDM2对Smad信号通路具有激活作用Real-time PCR检测结果显示,Slug和Snail的mRNA表达均可被MDM2所上调；由于Smad复合物直接激活Slug和Snail的转录,因此采用双荧光素酶报告系统检测MDM2对Smads转录复合物活性的影响,发现过表达MDM2时其转录活性增加,而采用siRNA技术沉默MDM2表达后,Smads复合物转录活性降低；Western blot及免疫荧光结果也进一步显示MDM2能够促使Smad2/3发生磷酸化,而Smad2/3总蛋白表达保持不变。4. Smad信号通路的激活为MDM2诱导EMT发生的前提采用siRNA技术沉默Smad2、Smad3和Smad4的表达,检测结果发现在Smad信号通路不能激活或是Smads复合物不能形成的情况下,MDM2下调E-cadherin蛋白表达的效应被不同程度的抑制,说明Smad信号通路的激活对MDM2发挥促EMT活性来说是必要的。5.沉默MDM2能抑制TGF-β诱导的EMT和细胞迁移Western blot和real-time PCR检测结果显示,TGF-β引起E-cadherin蛋白及转录水平的下调均能被沉默MDM2的表达所逆转；而进一步检测发现,TGF-β能同时增加Slug/Snail的蛋白和mRNA的表达,而沉默MDM2则可显著抑制二者的增加；在此基础上采用双荧光素酶报告基因系统检测了同样条件下Smads转录活性的变化,结果表明转入MDM2siRNA能降低TGF-β诱导Smads转录活性增加的程度；Western blot结果也显示,沉默MDM2能在一定程度上抑制TGF-β引起的Smad2/3磷酸化水平的增加；采用transwell和划痕修复检测SKOV3细胞运动能力的改变,发现TGF-β能明显诱导SKOV3细胞发生迁移,而这一效应可被沉默MDM2而有效地抑制。6.MDM2小分子抑制剂通过干预Smad信号通路的激活发挥抗EMT作用Western blot结果可知,Nutlin-3可以抑制由TGF-β以及MDM2高表达诱导的E-cadherin蛋白水平下调,从而抑制EMT的发生；进一步分析可知,Nutlin-3能够抑制由TGF-β和MDM2引起的Smad2/3磷酸化水平的增加；同时, Nutlin-3对Smad信号通路的转录激活产物Slug和Snail表达的增加也起到了抑制作用,说明抑制Smad信号通路的激活为其抗EMT的作用机制。结论：本课题对MDM2推动肿瘤恶性进程的作用机制进行了探讨,研究表明MDM2蛋白的表达与卵巢囊腺癌的临床分期具有相关性,提示MDM2可能作为生物标记物成为卵巢囊腺癌预后评价指标；进一步的机制研究发现MDM2可激活Smad信号通路来促使上皮来源的卵巢癌细胞发生EMT和迁移,同时发现MDM2抑制剂Nutlin-3具有抗EMT活性,这不仅表明MDM2可能成为潜在抗EMT乃至转移的治疗靶点,同时也为MDM2抑制剂的临床应用提供了新思路。