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乳腺癌是女性最普遍的恶性肿瘤,乳腺癌转移是造成患者死亡的主要原因,迄今为止乳腺癌转移的发病机理尚不清楚。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,活化后结合磷酸化特定的丝氨酸/苏氨酸残基。MAPK可被多种刺激(细胞因子、生长因子、神经递质、激素、细胞应激和细胞粘附等)所活化。MAPK被活化后可磷酸化转录因子和其它蛋白激酶等多种底物,调节相关基因表达,进而参与细胞生长、发育、分裂、迁移、代谢、细胞程序性死亡(凋亡)等多种生理过程。MAPK异常活化导致细胞分化、凋亡功能的丧失,引起细胞恶性转化,异常增殖、肿瘤发生、侵袭能力增强,最终导致肿瘤转移。传统的MAPK有三个家族成员组成:细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK);c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38 MAPK。ERK是MAPK家族中最早发现也是最重要的的亚类,在应答生长刺激时具有特征性。p-ERK ( phospho-ERK ),即磷酸化细胞外信号调节激酶,是ERK的活性形式,可进入细胞核,通过磷酸化活化转录因子而调控特定基因的表达。高转移乳腺癌细胞及组织活化ERK水平增高,p-ERK与临床病理分型正相关,p-ERK通常促进乳腺癌细胞增殖、抗凋亡及转移,但其作用机制不明。本研究拟用南开大学生命科学院叶丽虹教授等人的已获专利的高转移细胞系LM-MCF-7,揭示乳腺癌转移与ERK信号转导的关系。材料与方法:1.细胞培养和材料来源乳腺癌细胞系MCF-7和高转移乳腺癌细胞系LM-MCF-7(叶丽虹实验室建立,已获国家发明专利,发明专利号ZL 0310107316)均为南开大学生命科学院叶丽虹教授提供(参考叶丽虹,吴莲英,郭威,等..乳腺癌MCF-7细胞系转移亚克隆的筛选及其生物学特性研究.中华医学杂志. 2006;86(1):61-65)。MCF-7及LM-MCF-7细胞在含10%胎牛血清(FBS)、1×青链霉素、2mmol/L谷氨酰胺的RPMI1640(20mmol/L Hepes)培养基中, 37℃,5%CO2潮湿的培养箱中培养。细胞传代用0.25%胰酶消化。鼠抗人survivin单克隆抗体、兔抗人ERK多克隆抗体、兔抗人磷酸化ERK多克隆抗体购于Cell Signaling公司。Bcl-2、cyclin D1和caspase9多克隆兔抗人抗体购于NeoMarker公司。ERK抑制剂PD98059购于sigma公司2.蛋白免疫印迹分别取对数生长期的LM-MCF-7和MCF-7细胞,裂解、定量、电泳、转膜、封闭、加入抗体进行免疫印迹检测ERK、p-ERK的表达水平,结果显示LM-MCF-7细胞的p-ERK高表达。用不同剂量的ERK抑制剂PD98059作用于LM-MCF-7,再检测p-ERK的表达水平变化以及与细胞增殖、凋亡相关的蛋白Cyclin D1, Bcl-2,survivin,caspase-9表达有无变化。曝光后的图片用灰度扫描软件BandScan 4.5处理。用相对灰度值表示,即目的条带灰度值和上样内参β-actin或β-tubulin灰度值相比。3.统计学处理:数据以均数x±s标准差表示,各组之间的比较均采用student t检验。*p<0.05,**p<0.01,表示差异显著,具有统计学意义。结果:1.通过Western Blot检测发现LM-MCF-7细胞活化ERK即p-ERK水平明显高于MCF-7细胞系(Fig.1)。用ERK抑制剂PD98059处理LM-MCF-7细胞系后,p-ERK表达明显下调,并呈剂量依赖性(Fig.2)。2.LM-MCF-7细胞系细胞周期蛋白cyclin D1表达水平高于MCF-7细胞系。用ERK抑制剂PD98059处理LM-MCF-7后导致cyclin D1表达下调,表明ERK抑制剂可抑制cyclin D1的上调(Fig.3)。3.LM-MCF-7细胞系抗凋亡蛋白survivin表达水平高于MCF-7细胞系。采用不同剂量的ERK特异性抑制剂PD98059作用于具有高p-ERK的LM-MCF-7细胞系后,结果显示PD98059可拮抗survivin的上调,并呈剂量依赖性(Fig.4)。4.LM-MCF-7细胞抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平高于MCF-7细胞系。用ERK特异性抑制剂PD98059作用于具有高p-ERK的LM-MCF-7细胞系后,结果显示PD98059可拮抗Bcl-2的上调(Fig.5)。5.LM-MCF-7细胞凋亡蛋白水解酶caspase 9表达水平低于MCF-7细胞系。ERK特异性抑制剂PD98059作用于具有高p-ERK的LM-MCF-7细胞系后,结果显示PD98059可拮抗caspase 9的下调(Fig.6)。结论:1. p-ERK通过上调cyclin D1表达,促进乳腺癌细胞LM-MCF-7增殖。2. p-ERK通过上调抗凋亡蛋白survivin、Bcl-2,下调凋亡蛋白水解酶caspase 9,对LM-MCF-7细胞起抗凋亡作用。