天然免疫作为机体防御中最有效的一道防线,在大多数病原微生物感染的过程中发挥着至关重要的作用。当细菌等病原微生物入侵时,其保守的分子结构如细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、细菌脂蛋白(bacterial lipoprotein,BLP)、肽聚糖(peptidoglycan,PGN)等可以被巨噬细胞、肥大细胞、树突细胞、单核细胞等天然免疫细胞上相应的受体如Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)和NOD样受体(NOD-like receptors,NLRs)所识别,使机体产生对抗细菌感染的免疫反应。以上这些高度保守的细菌结构被称为病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),而分布于免疫细胞膜或者是胞浆内识别PAMPs的受体则被称之为模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)。当PRRs识别PAMPs后,可以通过一系信号分子激活核转录因子-κB(nuclear transcription factor-κB,NF-κB)、激活蛋白-1(activator protein,AP1)、干扰素调节因子(interferon regulatory factors,IRFs)等转录因子,引起促炎及抗炎的细胞因子、趋化因子等炎症介质的释放;与此同时,病原微生物则被吞噬细胞吞噬、杀灭,上述过程共同参与完成了机体对病原微生物的清除。NF-κB家族是天然免疫和获得性免疫过程中关键的调控分子。该家族由p50、p52、p65、c-Rel和RelB五个成员组成。当细胞处于静息状态时,以二聚体形式存在的NF-κB与其抑制蛋白IκBα等结合并分布于细胞质内;当细胞受到细菌等多种诱导因素刺激时,IκB蛋白发生磷酸化、泛素化并最终被蛋白酶体所降解。IκB蛋白的降解导致NF-κB二聚体得以释放并移位进入细胞核内,转位入核的NF-κB结合到靶基因的κB位点上,参与细胞因子、趋化因子、抗菌肽等多种基因的转录调控。现已知p65亚基与p50或p52亚基形成的异源二聚体是NF-κB的主要活性形式,并广泛分布于多种细胞内。BLP是革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌外膜中最丰富的蛋白,主要由生长或裂解的细菌释放。BLP作为PAMPs的一种,主要是通过PRRs中的Toll样受体2(Toll-like receptors 2,TLR2)启动天然免疫反应,引起单核细胞、巨噬细胞释放肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)等促炎细胞因子。这些促炎因子在机体清除病原微生物对抗感染的免疫过程中发挥着重要的作用,但它们不适当或过度的释放则会导致宿主发生脓毒性休克甚至是死亡。而机体(或细胞)对细菌细胞壁成分LPS、BLP等耐受的现象正是在研究炎症的合理性调控过程中被发现的。最初人们观察到实验动物或体外培养的单核/巨噬细胞等在给予小剂量的LPS预处理后,对LPS再次刺激无反应或反应性明显降低,表现为炎症因子分泌减少,机体炎症损伤减轻,动物在致死剂量内毒素再次刺激后的存活率提高,这一现象被称为LPS耐受。同LPS一样,以上所述的耐受现象也存在于用小剂量的BLP预处理后的实验动物或体外培养的单核/巨噬细胞中,被称之为BLP耐受。并且,已对BLP耐受的机体(细胞)可同时对LPS、细菌等发生交叉耐受,因此BLP耐受被认为是生物在长期进化过程中形成的一种保护意义更为广泛的适应性调节机制,是机体防御反应的重要组成部分,但目前对其机制尚未完全阐明。在机体(细胞)对BLP耐受时,典型特征之一是TLR信号通路下调,表现为 TLR2 及白介素-1 受体相关激酶 1(interleukin-1 receptor-associated kinase 1,IRAK-1)等重要分子的表达水平下调;TNF-α、IL-6等炎症因子释放减少;同时,研究发现已发生耐受的机体(细胞)对细菌的清除能力增强,这可能是BLP耐受发挥其保护作用的一个重要途径。目前关于在TLR信号通路下调的情况下,参与调控BLP耐受巨噬细胞细菌清除能力增强的信号转导机制还鲜有报道。吞噬作用是机体清除细菌等病原微生物等所必需的天然免疫过程之一,它主要由包括巨噬细胞在内的专职吞噬细胞来完成。吞噬过程一开始,吞噬细胞胞膜内陷包裹吞噬物而形成吞噬体,但它并不具备杀灭和降解病原微生物的能力。这些新形成的吞噬体必须经过一系列的生物学过程实现与溶酶体的融合,成为含有高活性氧化酶、酸化酶和水解酶的吞噬溶酶体,才能具备对吞噬物的清除能力,这个过程被称为吞噬体的成熟。吞噬体成熟是吞噬细胞发挥其清除细菌等正常功能所必不可少的生物学过程之一,该过程是由一系列相关的蛋白分子协同完成的。目前已知,溶酶体酶及膜转运调节因子在吞噬体成熟的过程中发挥着重要的作用。既然BLP耐受的机体(细胞)对细菌的清除能力增强,而细菌清除能力又与吞噬体成熟密切相关,那么探讨这些与吞噬体成熟过程相关的重要分子在BLP耐受时所发生的变化以及它们是否参与了 BLP耐受增强细菌清除能力的过程,阐明参与调控这些变化的相关信号分子及通路,将有助于我们更好地认识BLP耐受发挥其保护调节作用的具体机制。基于上述认识,本课题组前期以骨髓诱导分化的巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,BMM)为研究对象,利用基因表达谱PCR芯片(RT2 Profiler PCR Array)技术检测了 BLP耐受(100 ng/ml的BLP预处理24 h)和非耐受(Naive)的BMM在受到革兰氏阴性细菌感染时与吞噬体成熟和杀菌相关基因的差异表达情况,结果发现有8个基因明显上调,它们分别是acp2、acp5、rab10、rab20、rabgef1、acmp、ctsc、nos2。其中基因 acp2、acp5 所编码的蛋白是溶酶体的酸性磷酸酶 2/5(acid phosphatase 2/5,Acp2/Acp5),基因rab10、rab20所编码的是与吞噬体等膜性细胞器转运过程密切相关的Rab蛋白家族中Rab10、Rab20蛋白,基因rabgef1编码的是RAB鸟苷酸交换因子-1(RAB guanine nucleotide exchange factor 1,Rabgefl),基因 camp编码的是抗菌肽(cathelicidin antimicrobial peptide,Camp),基因ctsc编码的是组织蛋白酶(cathepsin C,Ctsc),基因nos2编码的是诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)。另外本课题组前期研究中还发现BLP耐受的BMM在接受细菌刺激时NF-κB通路可被重新激活。BLP耐受的巨噬细胞中,TLR信号通路下调,那么细菌刺激是否可通过胞质受体NOD1/2激活NF-κB通路;被活化的NF-κB通路是否参与了吞噬体成熟相关分子表达上调的过程,以及是否与BLP耐受巨噬细胞杀菌能力增强相关等,对于这些问题的解析,将有助于阐明BLP耐受的保护机制,为脓毒性休克的防治提供新的思路。基于上述研究认识和工作基础,本研究的目的如下:一、比较Naive和BLP耐受BMM对细菌的吞噬能力和杀灭能力。首先用异硫氰酸荧光素标记的大肠杆菌(fluorescein isothiocyanate labelled Escherichia coli,FITC-E.coli)感染BMM,然后分别利用荧光显微镜观察Naive和BLP耐受BMM对FITC-E.coli的吞噬能力,或者用多孔阅读器测定细胞裂解液的平均荧光强度,客观评价Naive和BLP耐受BMM对FITC-E.coli的吞噬能力;接下来利用杀菌实验比较了 Naive和BLP耐受BMM对活大肠杆菌的杀灭能力。二、验证前期RT2 Profiler PCR Array关于吞噬体成熟相关分子的筛选结果。首先利用Real-time PCR技术检测用100 ng/ml BLP预处理24 h后BMM内Acp2、Acp5、Rab10、Rab20、Rabgef1、Camp、Ctsc、iNOS 的 mRNA 水平;然后用Western blot在蛋白水平对Acp5和Rab10的变化情况进行了验证。三、观察细菌感染对Naive和BLP耐受BMM细胞p65活性的影响。利用细胞免疫荧光技术观察Naive和BLP耐受BMM内p65的定位以及热灭活伤寒杆菌刺激后的移位情况。四、探讨p65活化是否参与调控吞噬体成熟相关分子的表达。首先利用NF-κB特异性的抑制剂BAY-11-7082抑制NF-κB信号通路的活性,再利用Real-time PCR技术比较BAY-11-7082抑制组与DMSO对照组在伤寒杆菌刺激时Acp5、Rab10、iNOS等吞噬体成熟相关分子在mRNA水平的表达差异。五、探讨胞质受体NOD1、NOD2是否通过介导细菌感染BMM时p65的活化,参与调控吞噬体成熟相关分子的表达。首先,通过电转染特异性siRNA的方法同时下调BMM内NOD1和NOD2的表达,再利用细胞免疫荧光技术观察NOD1和NOD2双干扰组与NC对照组在伤寒杆菌刺激时p65的移位情况;最后,先通过电转染特异性siRNA的方法分别下调BLP耐受BMM内NOD1或NOD2的表达,再利用Real-time PCR技术分别检测NOD1或NOD2低表达对伤寒杆菌刺激所引起的Acp5、Rab10等吞噬体相关分子的mRNA表达水平变化的影响。六、探讨吞噬体成熟相关分子Rab10在BLP耐受BMM杀菌能力增强中发挥的作用。首先通过电转染特异性的siRNA的方法下调BLP耐受BMM内Rab10的表达,再比较干扰组与NC对照组在细菌吞噬和杀灭能力上的差异。实验结果如下:1.当细胞与FITC-E.coli共孵育30 min时,Zeiss荧光显微镜下见BLP耐受BMM胞浆内绿色荧光明显多于Naive细胞;此时,BLP耐受BMM细胞裂解液的平均荧光强度显著高于Naive的BMM(*P<0.05m,t test)。将BMM与活的E.coli共孵育30 min后撤去细胞外细菌,并将细胞放入培养箱中继续培养30 min或60 min,在30 min时间点Naive和BLP耐受的BMM对细菌的杀灭能力无明显差异,但在60 min两者对细菌的杀灭能力有显著差异(*P<0.05,t test)。2.Real-time PCR 检测的结果显示,BLP 耐受 BMM 内 Acp2、Acp5、Rab10、Rab20、Camp、iNOS 的 mRNA 水平显著(*P<0.05,ttest)高于 Naive 的 BMM,但Rabgef1、Ctsc的mRNA水平无统计学差异。Western blot的检测结果显示,BLP耐受后Acp5、Rab10的蛋白水平明显增加;随着伤寒杆菌刺激时间的延长Naive细胞Acp5、Rab10的表达水平增加,BLP耐受的细胞Acp5、Rab10的表达则一直处于较高水平。3.细胞处于静息状态时,Naive细胞p65几乎均分布于胞质,BLP耐受细胞p65则以胞质分布为主,但胞核内也有少量分布;当受到伤寒杆菌攻击时,无论是Naive细胞还是BLP耐受巨噬细胞,在30 min和60 min均可见p65主要分布于胞核,表明p65在细胞感染伤寒杆菌后迅速从胞质移位到胞核。p65移位入核提示NF-κB通路激活。4.用IκBα磷酸化抑制剂BAY-11-7082抑制NF-κB通路活化,检测感染细菌的巨噬细胞内Acp5、Rab10、iNOS mRNA的变化情况。结果发现:Naive细胞内Acp5,iNOS mRNA表达在60 min时与DMSO对照组间有显著差异,Rab10 mRNA无明显差异;BLP耐受细胞内Acp5、Rab10、iNOS mRNA表达在60 min时与DMSO对照组间均有显著差异。以上结果提示BLP耐受时,p65活化参与调控细菌感染巨噬细胞内Acp5、Rab10、iNOS的表达。5.细胞处于静息状态时,Naive细胞无论是NC组还是双干扰组p65主要分布于胞质;BLP耐受细胞无论是NC组还是双干扰组p65仍以胞质分布为主但胞核内也有少量分布。当受到伤寒杆菌攻击时,Naive细胞NC组在30 min和60 min均可见p65主要分布于胞核,双干扰组p65移位入核延迟,在胞质胞核均有分布;BLP耐受细胞NC组在30 min和60 min均可见p65主要分布于胞核,双干扰组p65移位入核延迟胞质胞核均有分布,但其与NC组的差异没有在Naive细胞中那样明显。p65移位入核延迟提示p65活化受到抑制。6.单独干扰NOD1时,BLP耐受巨噬细胞内Rab10、iNOS mRNA表达在60 min时与NC对照组有显著差异,Acp5 mRNA表达与NC组间差异不明显;单独干扰NOD2时,BLP耐受巨噬细胞内Acp5、Rab10、iNOS mRNA表达均在30 min时与NC对照组间有显著差异,但在60 min时与NC组间差异不明显。7.特异性siRNA下调BLP耐受巨噬细胞内Rab10表达后,吞噬实验结果显示干扰组与NC组相比细胞裂解液的平均荧光强度并无明显差异,提示干扰Rab10蛋白对细菌的吞噬没有明显影响;杀菌实验结果显示,下调Rab蛋白表达,无论在30 min还是60 min干扰组细胞与NC组对细菌的杀灭能力均有显著差异。根据以上实验结果,可以得到以下初步结论:1.与Naive细胞相比,BLP耐受巨噬细胞对细菌的吞噬能力和杀菌能力增强;2.BLP耐受巨噬细胞内与吞噬体成熟和杀菌相关分子Acp2、Acp5、Rab10、Rab20、Camp、iNOS 表达上调;3.BLP耐受巨噬细胞在感染细菌时p65可活化移位入核;4.p65活化参与调控感染细菌的巨噬细胞内Acp5、Rab10、iNOS mRNA的表达变化;5.BLP耐受时,胞质受体NOD1和NOD2介导了细菌感染巨噬细胞内p65的活化以及Acp5、Rab10、iNOS的表达调控;6.Rab10参与了 BLP耐受巨噬细胞杀菌能力增强的过程。