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肝癌在致死癌症中排名第三,是世界上常见的第六种恶性癌症。在发展中国家,肝癌的死亡率超过了 80%,肝癌已经成为了威胁公共健康的重要问题。大量研究数据显示:肝癌细胞的自噬水平普遍较低,这暗示自噬水平降低可能是肝癌发生的诱因。自噬是体内一种重要的保护性机制的分解代谢过程,即当正常生长时,自噬维持细胞自身的动态平衡;在抵抗外界生存压力时,自噬维持细胞正常的生长活力。自噬与癌症的发生发展密切相关,当自噬缺陷时会导致蛋白集聚毒性的加剧,损害细胞器,有时甚至会影响染色体组的完整性和稳定性,降低细胞活力,导致机体处于疾病状态,如细胞癌变、衰老或神经退化。但是在癌症发展的过程中,自噬可以帮助癌细胞抵抗失巢凋亡、化疗、放疗等压力,维持癌细胞生存活力,提高转移能力和抗药性。NRAGE是Ⅱ类MAGE家族的一员,除了包含MAGE同源结构域MHD外,还含有一个由25个WQXPXX六肽组成的重复结构域。前期研究发现:NRAGE可以直接和p75NTR的胞质部分相互作用,通过JNK依赖的线粒体凋亡途径,促进细胞凋亡;NRAGE可以通过BMP信号通路调节神经元细胞的凋亡;NRAGE可以下调抗凋亡因子Che-1,介导细胞凋亡;过表达NRAGE可以抑制细胞增殖、迁移和侵袭。由于NRAGE具有促进细胞凋亡和抑制细胞转移的功能,所以一直认为其是一种潜在的抑癌基因。然而最近有研究显示,在食管癌组织和细胞中,NRAGE的表达量较高,而且可以稳定PCNA,促进细胞增殖,这暗示NRAGE还可能通过其他途径参与肿瘤发生。我们实验室在前期研究中发现,相对于正常肝细胞,肝癌细胞NRAGE的表达水平较高,这暗示NRAGE可能与肝癌的发生发展有关。为了研究其对肝癌细胞增殖生长、细胞周期及迁移的影响,我们设计并合成3条siRNA小分子,转染HepG2细胞干扰NRAGE基因的表达。采用Western blot检测NRAGE蛋白的表达,QPCR检测NRAGE的mRNA水平;用流式细胞术分析细胞周期;分别应用MTS和细胞划痕实验检测HepG2细胞体外增殖和迁移能力的变化。实验结果显示:100nmol/LsiRNA能显著降低NRAGE的表达;100nmol/LsiRNA能显著下调NRAGE基因mRNA水平;NRAGE干扰后细胞活力降低;siRNA2小分子干扰HepG2细胞NRAGE后,G0-G1期细胞所占比例增大,S和G2-M期细胞所占比例显著下降;siRNA干扰NRAGE表达对HepG2细胞迁移没有明显影响。以上结果表明:siRNA干扰NRAGE基因表达后,肝癌细胞增殖受到抑制,细胞周期被阻滞在G0-G1期,但细胞迁移没有显著变化。前期研究还发现NRAGE敲除鼠的胚胎成纤维细胞(MEF)中自噬水平显著增加,这暗示NRAGE与细胞自噬可能存在某种联系:NRAGE功能缺失时,会导致细胞自噬活动增强。为了明确NRAGE基因对细胞自噬的影响,我们用100nmol/L siRNA干扰NRAGE基因表达,激光共聚焦显微镜分析LC3B荧光斑点数变化,免疫印迹检测自噬相关蛋白含量的变化,免疫荧光分析NRAGE与Beclin1共定位。结果显示:NRAGE干扰后,LC3B荧光斑点数增加、LC3B Ⅱ/Ⅰ比值增大,P62蛋白表达量降低,这表明干扰NRAGE基因后细胞自噬水平增加。在肝癌细胞株HepG2中,NRAGE主要分布在细胞核中,Beclin1主要分布在胞质中,但D-Hanks饥饿处理HepG2细胞15、30、60min后,NRAGE会出核,与Beclin1在细胞中的共定位相对增多,这暗示NRAGE可能通过与Beclin1结合,抑制自噬。值得注意的是,在NRAGE高表达的肿瘤中,如乳腺癌、前列腺癌、肺癌、恶性黑色素瘤、食管癌中,Beclin1的表达水平或多或少都低于正常的组织。因此通过本次研究我们猜测NRAGE可能通过与Beclin1相互作用,抑制肝细胞自噬,自噬水平的降低可能诱导肝癌的发生。