DNA疫苗(DNA vaccines)是将含有编码抗原基因的真核表达质粒直接接种体内,在体内表达相应抗原刺激机体产生针对该抗原的免疫应答,产生保护性免疫。DNA疫苗是在基因治疗和转基因技术基础上产生的第三代疫苗。然而DNA疫苗是一个新生事物,目前DNA疫苗大动物实验、人体临床实验结果表明DNA疫苗存在着给药剂量较大,生物利用度低,免疫效果个体差异大,不够理想的缺点,极大地阻碍了DNA疫苗的研究进展。除了DNA疫苗本身的免疫原性因素以外,主要原因是目前DNA疫苗的给药剂型是水溶液和冻干粉针注射剂,常用的免疫给药途径为肌内注射,由于DNA疫苗是由含2~10Kbp的质粒DNA构成的,分子量达百万,亲水性强,油水分配系数小,因而肌注给药后,DNA疫苗很难透过细胞膜,转运到组织细胞内,特别是到达吞噬细胞、树突细胞等抗原提呈细胞(APCs)的转运效率更低,只有很少量的药物能够转运到APCs内,转染表达,产生抗原,进行提呈,产生免疫效应,而绝大多数的药物在未转运至细胞前降解,从而导致免疫效果不理想。另外,同口服给药相比,注射给药方式也存在着不够方便、组织刺激性、成本高等不足。口服给药能诱导粘膜免疫,对大多数经粘膜感染的疾病防护是极为重要,但DNA疫苗在胃肠道内易降解,必须通过适宜的给药系统,保护药物、促进粘膜吸收。如何增强DNA疫苗的免疫效果、诱导产生粘膜免疫等课题是当前DNA疫苗研究的国际热点。 为了达到提高 DNA 疫苗的细胞内转运效率、提高免疫效果,降低给药剂量;增加给药途径,诱导粘膜免疫的目的,本文设计采用生物可降解材料海藻酸钠、PLGA为载体,以口蹄疫 DNA 疫苗为模型药物,制备了 DNA 疫苗海藻酸钠微球和 PLGA微球,并对微球的处方、工艺、释放特性及影响因素、理化特性、药物稳定性、免疫增强机理、体内外免疫效果、细胞毒性和组织刺激性等进行了较为系统的研究。 本文采用新型的乳化离子-交联法制备了口蹄疫 DNA 疫苗海藻酸钠微球,解决了传统的海藻酸钠微球制备方法的粒径大、不易控制的难题。该法无需有机溶剂,制备条件温和,有利于保持 DNA 疫苗结构和生物活性的稳定性。试验设计采用均匀设计法,考察制备工艺条件对粒径大小、包封率的影响。统计分析表明,搅拌速度、MC的用量对微球粒径大小的影响显著(P<0.01);理论载药量、搅拌速度对药物包封率的影响显著(P<0.01)。微球的体外释放试验表明,壳聚糖的固化比例高低是影响微球释 1<WP=6>第二军医大学博士学位论文 DNA 疫苗微球给药系统的研究 中文摘要放速率的主要因素:未壳聚糖固化的微球释放较快;壳聚糖固化后可显著延缓微球的释放,固化比例越高,释药速率越慢。载药量的高低、释放介质的种类对微球释放特性的影响较小。电泳分析表明,制备工艺、冷冻干燥工艺较好地保持了 DNA 疫苗的稳定性。 为了有利于微球产业化,本文进一步采用喷雾干燥法制备了 DNA 疫苗海藻酸钠微球,该方法具有以下优点:无有机溶剂残留、制备工艺简便、方便产业化生产应用。试验设计采用正交设计法,对影响微球的粒径大小的处方工艺因素进行了考察并对体外释放特性及影响因素进行了研究。结果表明,喷嘴的直径大小和海藻酸钠溶液的浓度对微球粒径大小的影响显著(P<0.01)。制备的微球粒径适宜,球形好、分散性好,具有明显的控制 DNA 疫苗释放的效果。电泳分析结果表明,该制备工艺可以较好地保持 DNA 疫苗的稳定性。 PLGA 为目前 FDA 已批准应用于注射途径给药的材料,是目前研究和应用最为广泛的微球材料。本文采用复乳化-溶剂挥发法制备了口蹄疫 DNA 疫苗 PLGA 微球,进行了微球理化特性的评价,考察影响微球载药量、包封率、粒径大小、DNA 疫苗稳定性的处方和工艺因素,研究了微球的体外释放特性及其影响因素。结果表明,搅拌速度对微球的粒径大小有显著影响,随着乳化搅拌速度的增大,微球的平均粒径减小;二氯甲烷溶液中 PLGA 的浓度增大,形成的微球粒径增大,微球的包封率也随之增大;药物与 PLGA 比例增加,微球的载药量相应提高,微球的包封率降低;随着PLGA 平均相对分子量(Mw)和特异性粘度(IV)的增加,微球的粒径增大,微球的包封率增大。微球中药物的释放速度受 PLGA 的平均分子量大小、微球的平均粒径大小、F68 的含量以及微球的载药量等因素影响。释放速度随着 PLGA 平均分子量大小的增大、微球平均粒径的增加而降低;随着载药量的增高、F68 用量的增高,微球的释放速度明显加快。微球的体外释放规律符合一级释药模型。稳定性研究表明,超声乳化是导致药物降解的主要因素。采取冰浴措施、缩短超声时间、加入缓冲液、DNA疫苗的稳定剂、冻干保护剂等措施可以有效减少药物在制备过程中的降解。PLGA 微球的初步稳定性试验表明,微球在在 4℃、室温条件下贮存 3 个月,外观形态、分散性能、体外释放和 DNA 疫苗的稳定性较好。 DNA 疫苗海藻酸钠微球的 DNA 酶保护试验,表明了微球对 DNA 酶具有一定的防护作用;通过体外电穿孔法转染 COS7 细胞试验,小鼠体内肌肉细胞转染试验,表明微球包裹后的 DNA 疫苗较好地保持了生物活性。小鼠体?