非受体酪氨酸蛋白激酶Src是最早发现的原癌基因表达蛋白之一。其以两种形式存在:病毒原癌基因表达蛋白v-Src和细胞原癌基因表达蛋白c-Src,两者在进化上具有高度同源性。真核细胞中c-src基因普遍存在,调节细胞的正常生长、增殖、分化、运动和凋亡等生理功能,c-Src蛋白在细胞信号转导过程中扮演重要角色。同时,c-Src蛋白的过量表达或激酶活性异常,与许多肿瘤的生成、入侵及转移密切相关,是一种公认的癌蛋白。 目前,国内外的研究主要侧重于c-Src与疾病相关的定位定性及调控细胞功能的分子机制等方面;而在应用上,人们已经预测c-Src蛋白激酶将成为研究疾病发生机理和筛选治疗药物的重要靶蛋白。因此,运用基因工程技术快速简便地克隆表达大量高活性的c-Src蛋白,用于激酶固定化筛选肿瘤抑制剂,将具有广阔的应用前景。 本文通过构建特异性c-src的原核表达重组质粒,转化大肠杆菌克隆表达得到完整的人源c-Src蛋白。首先,运用PCR技术,分别从人肺腺癌细胞总mRNA以及获赠的pcDNA3.1/Hygro质粒中,扩增出全长的人c-src基因。经测序鉴定该序列完全正确。然后,以克隆质粒pUCm-T为中介酶切连接,将c-src基因重组到pET-28a（+）、pET-22b（+）和pP_ROEX HTc等备选的表达载体,转化大肠杆菌中筛选阳性重组子,并用IPTG诱导表达、SDS-PAGE电泳检测,发现pP_ROEXHTc/c-src为高效的表达重组质粒,而在pET系列的重组质粒中c-src基因得不到明显表达。工程菌通过正交实验优化的表达条件是:30℃、0.1mM IPTG、5h,然后大量表达得到（His）₆/c-Src融合蛋白,在全菌蛋白表达含量中可以占20%以上。最后用（His）₆-Tag特异性亲和的Ni²⁺-NTA层析柱分离纯化,得到的高纯度c-Src融合蛋白,与经变性透析处理的包涵体蛋白分别测定酪氨酸蛋白磷酸化活性。结果证明,表达的c-Src融合蚩白具有一定的激酶活性,短小的（His）₆-Tag并不影响其结构和功能。这是国内首次在大肠杆菌原核表达体系中克隆表达得到完整的人c-Src蛋白激酶,为后期的进一步研究以及抗癌药物筛选奠定了基础。