【摘 要】
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目的探究钙蛋白酶-1（calpain-1）通过内质网应激促进低氧诱导肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension,PAH）肺动脉内皮细胞凋亡的作用机制。方法在体内实验中,取C57BL/6野生型小鼠16只,随机分为野生型对照组（WT Con）和野生型低氧模型组（WT Hypoxia）。取C57BL/6 calpain-1基因敲除小鼠16只,随机分为敲除型对照组（KO C
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目的探究钙蛋白酶-1（calpain-1）通过内质网应激促进低氧诱导肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension,PAH）肺动脉内皮细胞凋亡的作用机制。方法在体内实验中,取C57BL/6野生型小鼠16只,随机分为野生型对照组（WT Con）和野生型低氧模型组（WT Hypoxia）。取C57BL/6 calpain-1基因敲除小鼠16只,随机分为敲除型对照组（KO Con）和敲除型低氧组（KO Hypoxia）。小鼠于低氧仓中（10%O2）饲养4周,诱导成为肺动脉高压模型。平均肺动脉压（mPAP）≥25 mmHg视为肺动脉高压模型构建成功。检测小鼠右心室收缩压（Right ventricular systolic pressure,RVSP）、平均肺动脉压（mean pulmonary artery pressure,mPAP）、右心肥厚指数（Right ventricular hypertrophy index,RVHI）;苏木素-伊红（HE）染色观察肺小动脉形态学变化;免疫组化法（IHC）观察小鼠肺组织中calpain-1表达水平;TUNEL染色观察小鼠肺组织肺小动脉内皮细胞凋亡;Western blot检测小鼠肺组织中 calpain-1,pPERK,CHOP,GRP78,caspase-12,caspase-3,Bax,Bcl-2蛋白表达水平。在体外实验中,培养HPAECs24h后,在常氧或低氧（3%O2）条件下继续培养24 h,实验分为正常对照组（Con）、低氧模型组（Hypoxia）、低氧+calpain-1抑制剂组（Hypoxia+MDL28170）和低氧+ERS抑制剂组（Hypoxia+4-PBA）。在培养基中加入相应的抑制剂后,免疫荧光（IF）观察各组HPAECs中calpain-1,caspase-3蛋白表达情况;流式细胞仪检测各组细胞凋亡率;Western blot 检测各组 HPAECs 中 calpain-1,pPERK,CHOP,GRP78,caspase-3,Bax,Bcl-2 蛋白表达水平。结果体内水平上:（1）WT Hypoxia组与WT Con组相比,小鼠血流动力学指数显著升高（P＜0.05）;肺小动脉血管壁厚度比率（WT%）和血管壁面积比率（WA%）显著升高（P＜0.05）;肺小动脉内皮细胞凋亡增加;小鼠肺组织中calpain-1,pPERK,CHOP,GRP78,caspase-12,caspase-3,Bax 蛋白表达水平增加,Bcl-2蛋白表达水平降低（P＜0.05）。（2）KO Hypoxia组与WT Hypoxia组相比,小鼠血流动力学指数显著降低（P＜0.05）;肺小动脉血管壁厚度比率（WT%）和血管壁面积比率（WA%）显著降低（P＜0.05）;肺小动脉内皮细胞凋亡减少;肺组织中 calpain-1,pPERK,CHOP,GRP78,caspase-12,caspase-3,Bax蛋白表达水平降低,Bcl-2蛋白表达水平增加（P＜0.05）。体外水平上:（1）Hypoxia组与Con组相比,细胞凋亡率显著增加（P＜0.05）;细胞中 calpain-1,pPERK,CHOP,GRP78,caspase-3,Bax 蛋白表达水平增加,Bcl-2蛋白表达水平降低（P＜0.05）。（2）Hypoxia+MDL组与Hypoxia组相比,细胞凋亡率显著降低（P＜0.05）;细胞中calpain-1,pPERK,CHOP,GRP78,caspase-3,Bax 蛋白表达水平降低,Bcl-2 蛋白表达水平增加（P＜0.05）。（3）Hypoxia+4-PBA组与Hypoxia组相比,细胞凋亡率显著降低（P＜0.05）;细胞中calpain-1蛋白表达水平变化无意义（P＞0.05）,pPERK,CHOP,GRP78,caspase-3,Bax 蛋白表达水平降低,Bcl-2蛋白表达水平增加（P＜0.05）。结论结果表明,calpain-1通过促进内质网应激加速低氧诱导肺动脉高压肺动脉内皮细胞的凋亡。（1）低氧时calpain-1活性增强,促进内质网应激,肺动脉内皮细胞凋亡增多。（2）抑制calpain-1可改善肺小动脉重构,减轻内质网应激和肺动脉内皮细胞凋亡的发生。（3）抑制内质网应激不影响calpain-1活性但减少肺动脉内皮细胞凋亡。
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