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青光眼是临床常见的致盲眼病,主要的致盲原因是眼内压(intraocularpressure,IOP)升高。急性闭角型青光眼病人的IOP可迅速升高至40～80 mmHg,可在短时间内导致视网膜节细胞(Retinal Ganglion Cell,RGC)损伤而出现视力缺损。中等程度的IOP升高可导致大鼠视网膜电流图改变。而且在人的研究中也发现,IOP超过30 mmHg可导致图像视网膜电流图幅度产生可逆性降低,IOP过高则会造成视网膜外层出现损伤。现在多数研究组都采用原发性开角型青光眼模型,而这些模型不能很好的模拟急性闭角型青光眼所造成的视网膜功能和形态学改变。我们改进的青光眼模型可以对这种青光眼的病理和形态学改变做深入研究。
为了选择性损伤视网膜内层,我们将大鼠的IOP升高到与临床发生青光眼相当的中等程度,即45 mmHg水平。大多数研究都认为短暂的IOP升高对视网膜内层造成可逆性的功能损伤。视网膜损伤程度除了与IOP升高的幅度有关以外,IOP升高的持续时间也是一个非常重要的因素,持续IOP升高会造成视网膜不可逆损害。我们采用的模型可非常好的解决IOP的高度和持续时间等问题。
c-Jun氨基末端激酶(c-Jun-NH2-terminal kinase,JNK)是促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)超家族的一员,参与细胞凋亡、炎症和癌变等病理过程。有学者报道JNK参与了青光眼诱导的RGC凋亡,还有学者报道SP600125可逆转兴奋性中毒导致的RGC的凋亡,但SP600125是否可保护中等程度的IOP升高诱导的RGC损伤尚未见报道。
因此,本研究的目的有两个方面,一是观察中等程度的IOP升高并持续不同时间对视神经和视网膜的损伤情况,二是观察SP600125是否对IOP升高引起的视网膜损伤具有保护作用。
材料和方法:实验选用健康雄性Wister大鼠(200～250 g),自由饮食。实验前麻醉大鼠、通过缝线.滑轮系统升高IOP,实验过程中监测IOP和血压,保持大鼠体温正常。部分大鼠在高IOP前5 min,高IOP结束后,高IOP后2天、3天、4天、5天、6天和7天腹腔注射SP600125(分别为1.5 mg／kg、5 mg／kg、15 mg／kg)观察其对视网膜的保护作用。实验完成后摘取眼球,通过视神经损伤评分评估不同时间的高IOP造成的视神经损伤情况；在视网膜组织切片上测量视网膜各层厚度和视网膜节细胞层(Retinal Ganglion Cell layer,RGCL)细胞密度；采用葡聚糖四甲基罗丹明(Dextran Tetramethyl Rhodamine,DTMR)逆行标记RGC；在视网膜铺片上用Brn-3a特异标记RGC。
所有数据均采用均数±标准误表示,采用单因素方差分析比较多组间的差异,t检验比较两组间的差异,以P<0.05为显著性差异界值。
实验结果:
1.砝码重量为5 g、10 g15 g、20 g、25 g的滑轮-缝线系统持续施压1 hr分别使IOP升高至17.3±0.3 mmHg、33.9±0.5 mmHg、47.0±0.1 mmHg、61.4±0.5 mmHg和79.3±0.3 mmHg。实验期间平均动脉压稳定(81.99±3.45 mmHg)。
2.IOP升高持续时间越长,对视神经造成的损伤也越严重。视神经损伤评(optic nerve damage score,ONDS)分在中等程度IOP(45 mmHg)1～4 hr没有明显变化,5～7 hr评分越来越高,分别为2±0.33、2.9±0.21、3.8±0.07,高于阴性对照组(P<0.05)。
3.中等程度IOP持续时间5～7 hr可导致RGCL细胞密度降低和视网膜内层(内界膜.内丛状层,Inner limiting membrane—outer plexiform layer,ILM—OPL)变薄。中等程度IOP升高5～7 hr后,视网膜内层厚度分别为86±2.1μm、82±5.0μm、63.2±2.2μm,较IOP升高前(90.2±0.6μm)明显变薄(P<0.05)；视网膜节细胞层(Retinal ganglion cell layer,RGCL)细胞密度分别为9±0.8／300μm、8±0.9／300μm、6±1／300μm,较IOP升高(12.4±0.4 cells／300μm)明显降低(P<0.05)。
4.IOP持续升高7 hr可导致DTMR标记RGC密度降随动物存活时间延长而降低。IOP升高后第3 d、7 d、14 d、21 d和28 d,RGC密度分别为1388±71／mm2、1291±103／mm2、1203±71／mm2、1031±37／mm2、833±63／mm2和671±53／mm2,均较正常IOP组明显降低(P<0.05)。
5.JNK阻断剂SP600125对高IOP损伤造成的视网膜损伤有明显保护作用。正常眼压组(normal IOP+vehicle)、IOP升高+溶剂对照组(high IOP+vehicle)和IOP升高+SP600125(high IOP+SP600125)处理组视网膜全层厚度分别为207.1±4.40μm、170.9±8.2μm(P<0.05 vs.control)和201.5±9.1μm(P<0.05vs.high IOP+vehicle)视网膜内层厚度分别为:84.8±1.4μm、60.0±3.8μm(P<0.05 vs.control)、80.8±3.7μm(P<0.05 vs high IOP+vehicle)视网膜节细胞层(RGCL)细胞密度分别为:12.7±O.24 cells／300μm、6.1±0.8 cells／300μm(P<0.05 vs control)、12.5±0.7 cells／300μm(P<0.05 vs.high IOP+vehicle)。
6.SP600125对IOP升高造成的RGC损伤有明显保护作用。正常眼压+溶剂对照组、IOP升高+溶剂对照组和IOP升高+SP600125处理组视网膜中心Brn-3a阳性细胞密度分别为3542±85／mm2、1481±99／mm2(P<0.05 vs.normalIOP+vehicle)和3044±97／mm2(P<0.05 vs.high IOP+vehicle)视网膜外周节细胞密度分别为3225±108／mm2、1496±152／mm2(P<0.05 vs.normal IOP+vehicle)和2282±88／mm2(P<0.05 vs.high IOP+vehicle)。
结论:中等程度的IOP升高(45 mmHg)持续7 llr可选择性损伤视网膜内层和RGCs； SP600125可保护视网膜免受高眼压导致的视网膜内层和RGCs损伤,提示JNK阻断剂可能做为青光眼的治疗药物。