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缺血性卒中是人类致死与致残的主要疾病之一,通常发生在向大脑供血的血管被堵塞时,局部缺血引发缺血级联反应,诱导一系列分子事件,包括能量衰竭、离子失衡、兴奋性毒性、氧化应激、细胞死亡（凋亡或坏死）和神经炎症等。这种级联反应最终导致不可逆的脑损伤。目前针对缺血性脑损伤已经开发了多种治疗策略,主要是溶栓治疗与神经保护剂干预。组织纤溶酶原激活剂（tissue—type plasminogen activator,t-PA）溶栓是缺血性卒中最有效的治疗方法,但其治疗窗窄（≤4.5 h）且伴有出血风险及血管源性水肿等严重不良反应。大多数神经保护剂也存在不可忽视的缺陷,如溶解度低、半衰期短和体内血脑屏障（Blood Brain Barrier,BBB）通透性差等。因此需要寻找更安全、更有效的治疗缺血性卒中的新药。神经生长因子（Nerve Growth Factor,NGF）是一种神经营养因子,它在神经损伤相关部位的功效已经得到了广泛深入的研究和认识,NGF已被证实能够促进神经元的存活、分化和成熟,在调节神经系统和免疫系统之间的双向信号网络以维持内环境的稳态方面也起着重要作用。一些NGF的临床研究集中于修复周围神经系统（Peripheral Nervous System,PNS）和中枢神经系统（Central Nervous System,CNS）中的神经损伤,包括周围神经病变、视神经损伤、缺血性中风和神经退行性疾病。重组人神经生长因子（Recombinant human NGF,rhNGF）是NGF的重组蛋白,其生物学功能最接近天然蛋白质分子,能够代替NGF促进神经再生,并为损伤后的神经修复提供营养支持,而CHO细胞表达的rhNGF具有高活性、低免疫风险以及广阔的市场前景。在动物缺血性脑损伤模型研究中发现,通过脑室原位注射、滴鼻或者使用病毒载体负载的方式将NGF递送至大脑,对神经功能有一定的改善。然而rhNGF在缺血性脑损伤中的神经保护作用及其机制尚不完全清楚。本研究首先在缺血性脑卒中大鼠模型上观察到了rhNGF的治疗作用,进一步研究了rhNGF神经保护的作用机制,研究内容及结果如下:1.rhNGF对缺血性卒中大鼠模型的疗效。采用雄性SD大鼠通过线栓法缺血2 h构建大鼠大脑中动脉阻塞（Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO）模型,实验设置为Vehicle组和rhNGF组（n=10）,通过尾静脉注射给予200μg·m L-1rhNGF,1次/天,连续给药3天,进行行为学检测评价其神经功能,通过TTC染色测定脑组织梗死体积。结果显示rhNGF可显著减少模型大鼠的脑梗死范围,可改善部分神经功能缺损程度,说明rhNGF对缺血性脑损伤有一定的治疗作用。2.rhNGF对神经炎症的调节作用。首先探索了rhNGF对神经炎症反应的调节作用,通过LPS诱导小鼠小胶质细胞（BV2细胞）建立慢性细胞炎症模型,采用CCK-8法检测LPS的细胞毒性作用和rhNGF对细胞活力的影响,通过实时荧光定量PCR检测炎性细胞因子的基因表达水平。结果显示1、10、100μg·m L-1 LPS可剂量依赖性地降低BV2细胞活力,同时可引起BV2细胞的炎症反应。选取1μg·m L-1LPS作为建立细胞炎性模型的造模浓度。50或500 ng·m L-1 rhNGF可显著提高BV2细胞活力,作为后续的干预浓度。接下来,通过CBA法检测炎性因子的蛋白表达水平,免疫荧光法检测BV2细胞的极化状态,Western Blot法检测介导rhNGF抑炎作用的相关通路。结果显示在BV2细胞炎症模型上,rhNGF显著降低过度激活的BV2细胞中促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的基因与蛋白表达,促进抗炎因子IL-4和IL-10的基因表达,因此rhNGF抑制LPS诱导的BV2细胞的促炎反应,发挥抑炎作用。同时,基于小胶质细胞的可塑性,我们观察到rhNGF能够诱导BV2细胞从促炎M1表型转换为抗炎M2表型,从而调节炎性反应。提示rhNGF对小胶质细胞表型转化的调节可能是其抗炎机制的一部分。因此,rhNGF通过调节小胶质细胞的极化状态,诱导小胶质细胞炎症向有利于病理发展的方向转化,从而发挥神经保护作用。此外,在LPS活化的小胶质细胞中NFκB被激活,而rhNGF干预则降低了NFκB的磷酸化水平,提示NFκB通路可能介导了rhNGF的炎性调控作用。3.rhNGF对神经细胞凋亡的影响。为了研究rhNGF对神经细胞的保护作用,建立了基于小鼠神经母细胞瘤细胞（N2a细胞）的Na2S2O4诱导缺氧损伤模型。使用CCK-8法检测细胞活力,发现2.5 mmol·L-1Na2S2O4能够降低N2a细胞活力至60%,可用于神经保护作用的体外评价。同时,将N2a细胞与BV2细胞及其条件培养基共同培养,模拟炎症状态下神经细胞的损伤。通过Tunel与免疫荧光共染和流式细胞术检测炎症或缺氧诱导的神经细胞凋亡情况,结果显示Na2S2O4和小胶质细胞炎症都能引起N2a细胞的凋亡,LPS激活的BV2细胞及其培养基比LPS单独作用时对N2a细胞的损伤更大,而rhNGF可以显著减少由炎症或缺氧诱导的N2a细胞凋亡。使用Western Blot检测PI3K蛋白是否介导rhNGF的抗凋亡作用,结果显示rhNGF可激活PI3K蛋白,并抑制PI3K下游促凋亡蛋白半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3（Cysteine-Dependent Aspartate-Directed Proteases 3,Caspase-3）活性。综上,rhNGF能够抑制由缺氧或炎症诱导的神经细胞凋亡,从而发挥神经保护作用,而PI3K通路可介导其凋亡抑制作用。结论:rhNGF在大鼠MCAO模型中显示出减少梗死体积和改善部分神经功能的保护作用,在BV2细胞炎症模型中可通过调整小胶质细胞的极化状态发挥抑炎作用,抑制小胶质细胞炎症介导的神经细胞凋亡,同时在神经细胞缺氧时也具有抑制细胞凋亡的保护作用。rhNGF可通过抑制NFκB炎症通路进而抑制下游的炎性因子的表达来调控炎症反应,还可以激活PI3K,抑制下游的Caspase-3活性,发挥抑凋亡的神经保护作用。总之,rhNGF可通过抑制神经炎症与细胞凋亡发挥神经保护作用,为缺血性脑损伤的治疗提供了新方向。