类风湿性关节炎（RA）是全世界主要的慢性破坏性疾病,其特征在于关节肿胀,滑膜炎症、软骨和骨质破坏。虽然RA的致病机因和病理生理学至今尚未明了,但研究表明在RA的发病机制中,淋巴细胞作用至关重要。机体免疫器官主要分为中枢免疫器官和外周免疫器官两部分。中枢免疫器官包括胸腺和骨髓等,在胚胎发育早期出现;外周免疫器官包括脾脏和淋巴结等,在胚胎发育中出现较迟。免疫细胞种类繁多,包括T淋巴细胞、B淋巴细胞和树突状细胞等。RA患者血清中PGE2水平显著增加,值得关注的是PGE2通过G蛋白偶联的前列腺素E2受体信号传导途径调节细胞内环磷酸腺苷（cAMP）的水平。G蛋白偶联受体激酶（GRKs）作为G蛋白偶联受体（GPCRs）的重要负调控因子,引起的GPCR磷酸化促进了arrestins与GPCR的结合,使GPCR脱敏。课题组前期研究结果发现在佐剂性关节炎（AA）大鼠和胶原性关节炎（CIA）大鼠中,GRK2的表达均发生显著性变化;但GRK2对T淋巴细胞中EP信号尤其是对EP4信号的调节未见报道。新型活性单体药物-芍药苷-6-氧-苯磺酸酯（代号CP-25,专利号ZL201210030616.4）是课题组前期对芍药苷（Pae）进行酯化修饰后得到的新型活性单体,表现出较强的抗炎和免疫调节作用。研究表明CP-25可以通过调节PGE2-EP4-cAMP和TNF-α-TNFR1-TRADD-TRAF2-NF-κB信号通路改善RA症状,CP-25还可以通过调节由BAFF和TNF-α-TRAF2-NF-κB信号通路介导的经典的和非经典的NF-κB信号通路来适度调节B细胞功能发挥抗炎和免疫作用,同时研究还发现CP-25可以改善AA大鼠整体指标和降低促炎因子分泌水平显著改善RA症状。本研究拟在AA大鼠模型上以AA大鼠胸腺和脾脏组织为主要研究对象观察了GRKs和EP受体亚型的表达特点,并在脾脏来源的T细胞中运用流式细胞术、免疫荧光、ELISA和免疫共沉淀等技术深入研究了AA大鼠炎症状态下T细胞功能的变化及CP-25的作用机制,进一步揭示了CP-25的抗炎免疫作用和特点。目的:观察AA大鼠胸腺和脾脏组织EP受体亚型及GRKs的表达特点,揭示AA大鼠炎症状态脾脏来源T细胞的功能变化,为阐明CP-25调节T细胞功能提供理论依据。方法:AA模型由完全弗氏佐剂诱导产生,成模后第17天炎症开始出现。实验分组如下:正常组（Normal group）、AA模型组（AA group）和CP-25（50 mg/kg）组（CP-25 group）,每组8只大鼠。所有给药组按大鼠体重计算给药剂量（50 mg/kg）,从第17天开始,每天灌胃给药一次,连续给药13天。正常组与模型组根据大鼠体重给予相同溶剂羧甲基纤维素钠溶液平行对照灌胃给药。每3天测量一次足爪肿胀度。处死前一天禁食,股动脉放血,分离胸腺和脾脏组织,称量各组大鼠胸腺和脾脏的重量,计算各组大鼠胸腺指数和脾脏指数;取胸腺和脾脏组织,制作切片进行病理学检查,包括脾脏组织HE染色、胸腺和脾脏组织免疫组化染色;免疫组化法观察GRK2,3,5,6和EP1,2,3,4在各组胸腺和脾脏组织中的分布与表达;Western Blot观察GRK2,3,5,6和EP1,2,3,4在各组中的表达水平;免疫荧光激光共焦法检测各组中GRK2与EP2以及GRK2和EP4的共表达。为了检测AA大鼠炎症状态T细胞功能的变化及CP-25的作用,我们首先体外用ConA刺激T细胞,然后加入CP-25(10^-6 mol/L),CCK8法检测脾脏T细胞增殖能力及CP-25的作用影响,随后用ELISA法检测T细胞特异性分泌的炎症因子白细胞介素-2（IL-2）和干扰素-γ（IFN-γ）水平;然后采用流式分选技术,得到纯度较高的T细胞,采用ELISA法检测T细胞内cAMP水平,最后用免疫荧光激光共焦法检测各组T细胞中GRK2的表达水平,免疫荧光激光共焦法联合流式细胞术检测各组T细胞中EP4的表达水平。结果:1.CP-25对AA大鼠整体指标的影响在AA大鼠发病第17天开始可以明显观察到大鼠足爪肿胀度较正常组明显上升;HE检查大鼠脾脏组织发现模型组大鼠脾脏与正常组相比白髓与红髓界限模糊,可见明显的白髓增生,出现生发中心,红髓增生,淤血增多;AA大鼠胸腺和脾脏较正常组大鼠明显肿大,胸腺指数和脾脏指数显著升高。CP-25可以显著降低AA大鼠足爪肿胀度,改善白髓与红髓间界限,减少粒细胞浸润,并且可显著降低AA大鼠胸腺和脾脏指数。2.CP-25对AA大鼠胸腺和脾脏组织中GRKs和EPs表达的影响免疫组化法检测AA大鼠胸腺和脾脏组织中GRKs和EPs,结果发现GRK2,EP2和EP4的表达明显升高,且蛋白只表达于脾脏的红髓区域和胸腺的皮质部位;Western blot检测结果发现AA大鼠胸腺和脾脏组织中GRK2,EP2和EP4的表达明显升高;Q-PCR检测发现AA大鼠脾脏组织的GRK2和EP4的基因发生明显变化。CP-25可以显著下调AA大鼠胸腺和脾脏组织中GRK2,EP2和EP4的蛋白表达水平。3.CP-25对AA大鼠胸腺和脾脏组织中GRK2和EP2以及GRK2和EP4共表达的影响免疫共沉淀法检测大鼠胸腺和脾脏组织中GRK2和EP2以及GRK2和EP4共表达,结果发现仅在AA大鼠脾脏中GRK2和EP4共表达较正常组大鼠显著上升,而CP-25可以显著下调AA大鼠脾脏中GRK2和EP4共表达水平;激光共聚焦检测进一步证实了这个结果;在AA大鼠脾脏中GRK2与EP2的共表达较正常组有降低的趋势,CP-25给药后较AA模型组有升高的趋势,但是三组之间无差异性。AA大鼠胸腺组织中,GRK2和EP2以及GRK2和EP4共表达正常组、模型组和CP-25给药组三组之间无差异性。4.CP-25对脾脏来源的T细胞增殖的影响与正常组比较ConA明显促进T细胞增殖。与ConA组相比CP-25可以显著抑制T细胞增殖。5.CP-25对AA大鼠T细胞分泌的炎症因子水平的影响ELISA检测大鼠脾脏匀浆上清液,结果发现,与正常组相比,AA模型组IL-2和IFN-γ水平显著升高,CP-25给药明显下调T细胞分泌的IL-2和IFN-γ水平。6.CP-25对AA大鼠T细胞内cAMP水平的影响正常组、AA模型组和CP-25组脾脏淋巴细胞分选出纯度较高的T细胞（纯度为95%）,ELISA检测T细胞内cAMP水平,结果发现,与正常组相比,AA模型组cAMP水平明显下降,CP-25可以显著恢复模型组下降的cAMP水平。7.CP-25对脾脏来源T细胞中的GRK2和EP4表达的影响与正常组比较,AA模型组中脾脏来源T细胞中GRK2和EP4的表达明显升高。与AA模型组相比,CP-25可以显著下调脾脏来源T细胞中的GRK2和EP4的表达;流式细胞术检测脾脏来源T细胞中EP4的表达,结果与上述一致。结论:1.CP-25可以有效减轻AA大鼠关节肿胀度和改善AA大鼠的脾脏组织病理学。2.AA大鼠炎症期胸腺和脾脏组织中GRK2,EP2和EP4异常升高,而CP-25可以显著下调GRK2,EP2和EP4的高表达水平。3.AA大鼠脾脏组织中GRK2与EP4的共表达水平升高,而CP-25可以显著下调其共表达水平。4.AA大鼠T细胞分泌的IL-2和IFN-γ水平显著升高,而CP-25可以显著下调其分泌水平。5.T细胞功能的异常可能与EP4-cAMP信号通路有关,而CP-25可以通过作用EP4-cAMP信号通路适度调节T细胞功能,发挥抗炎免疫作用。