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本试验以毛豹皮樟的叶片为材料,通过对不同的DNA提取方法进行试验,寻找最佳的毛豹皮樟DNA提取方法;优化扩增程序和反应条件,建立起毛豹皮樟的RAPD技术体系;并将该技术体系应用于80个毛豹皮樟叶片的RAPD扩增中。结果表明: 一、使用改良SDS提取法有效地解决了毛豹皮樟基因组总DNA提取中的褐变问题,同时所提取的DNA均呈白色絮状,A260/A280值都在1.8以上,从检测所得产率和纯度可知该DNA模板完全可以用于RAPD分析;另外,该方法还具有成本低、操作简单、省时等特点。 二、用CTAB法提取毛豹皮樟叶片的DNA时,所得DNA量很少,而且模板中含色素、蛋白质等杂质很多,在后期进行RAPD扩增时,杂质的影响导致扩增不稳定或者扩增失败,表明CTAB提取法对于含酚类等次生物质较多的物种并不适用。采用常规的SDS法所得的DNA量很少,而且模板中含色素、蛋白质等杂质很多,在后期进行RAPD扩增时,杂质的影响导致扩增不稳定或者扩增失败。 三、扩增程序采用:预变性温度为94℃1min,变性温度为94℃1min,复性温度为34℃1min,72℃延伸2min,共45个循环,最后72℃延伸10min,同时反应体系(20μl反应体系)采用:dNTPs0.4μl(各含1Nm/μl),10×PCR2μl,MgCl2μl,Taq酶0.3μl(0.5u/μl),H2O11.3μl,DNA模板2μl(40ng),Primer2μl(0.8Pm/μl),能够得到清晰稳定的扩增带谱。 四、将所建立的RAPD技术体系应用于20个毛豹皮樟叶片DNA的RAPD扩增中,筛选出16个引物,所得的谱带清晰,多态性高达46.8%,反映了各试材之间在DNA序列上存在相当大的差异,可用于毛豹皮樟的种质资源鉴定分析。 五、用筛选出的部分随机引物对80个毛豹皮樟的DNA模板进行RAPD扩增,得到了稳定的RAPD带谱。这些特征引物对各种材料扩增所得到的特征谱带反映了基因组总DNA碱基序列的特异性,可用于聚类分析。