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抗菌肽是先天免疫应答的重要组成部分,广泛存在于动物、植物和微生物体内。与传统抗生素抑制细胞内特定靶位不同,大多数抗菌肽主要通过非受体介导的膜透化作用杀死细菌,正因此种独特机制,促使抗菌肽有潜力发展成为抗生素替代品,然而由于天然抗菌肽常具有抗菌活性差、稳定性差及细胞选择性低等缺陷,严重阻碍其进一步发展。因此,设计新型抗菌肽以克服天然抗菌肽的劣势具有重要意义。
本研究在深入理解抗菌肽结构与功能关系的基础上,设计一系列含有七肽重复序列和β-转角结构的抗菌肽分子,序列模板为XXYXXYYzzYYXXYXX-NH2[X代表异亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)或亮氨酸(Leu);Y代表赖氨酸(Lys)或精氨酸(Arg);zz代表甘氨酸-甘氨酸(Gly-Gly)或D型脯氨酸-甘氨酸(D-Pro-Gly)]。生物学活性结果显示,在所有设计肽中,抗菌肽LRpG凭借其最优的结构参数平衡,对革兰氏阴性菌表现出最佳的平均抗菌活性(GMMIC=3.5μM)和治疗指数(GMTI=73.14)。此外,环境敏感性分析及联合药敏试验结果显示,抗菌肽LRpG具有较好的盐离子、温度、pH及血清耐受性,且与临床常用抗生素具有体外相加抗菌作用。
为了研究抗菌肽LRpG的抑菌机理,本研究利用荧光探针技术及电子显微观察技术检测了抗菌肽LRpG对细菌细胞膜完整性的影响,采用DNA凝胶阻滞试验及ROS聚集试验检测了抗菌肽LRpG对细菌基因组DNA的影响。结果显示,抗菌肽LRpG可通过细胞膜损伤作用和DNA结合作用杀死细菌,且以物理破膜作用为主。其杀菌过程为:抗菌肽LRpG首先穿透细菌细胞膜,破坏质膜完整性,引起内容物泄漏,随后进入细胞内部,与细菌基因组DNA结合,影响细菌正常生命活动,导致细菌死亡。
为了研究抗菌肽LRpG对细菌内毒素(LPS)的中和作用,本研究通过鲎试剂显色试验和LPS竞争性抑制试验证实抗菌肽LRpG对LPS具有较强的结合作用,且呈浓度依赖方式。在上述研究的基础上,为了进一步探究抗菌肽LRpG对LPS诱导炎症反应的抑制能力,本研究构建了LPS诱导的小鼠巨噬细胞炎症模型,并使用小鼠细胞因子ELISA试剂盒测定抗菌肽LRpG对炎症介质释放的影响。结果显示,抗菌肽LRpG能够以浓度依赖的方式抑制炎性介质TNF-α、NO、IL-6及IL-1β的过量释放。
为了降低成本并大量获得具有较高治疗指数的抗菌肽LRpG,本研究选用原核表达系统对其进行串联表达。根据大肠杆菌密码子偏嗜性,设计并合成抗菌肽LRpG的4倍串联体基因,采用同尾酶串联法构建多基因串联体nLRpG(n=4、8、12或16),随后将上述片段分别连接到pET-32a(+)表达载体中,成功构建pET-32a-nLRpG(n=4、8、12或16)重组表达质粒。经IPTG诱导表达后,利用亲和层析技术,成功获得16LRpG融合蛋白。采用羟胺专一性裂解及高效液相纯化技术成功获得LRpG单体,其生物学活性和二级结构均与化学合成法制备的抗菌肽LRpG一致。
本研究在深入理解抗菌肽结构与功能关系的基础上,设计一系列含有七肽重复序列和β-转角结构的抗菌肽分子,序列模板为XXYXXYYzzYYXXYXX-NH2[X代表异亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)或亮氨酸(Leu);Y代表赖氨酸(Lys)或精氨酸(Arg);zz代表甘氨酸-甘氨酸(Gly-Gly)或D型脯氨酸-甘氨酸(D-Pro-Gly)]。生物学活性结果显示,在所有设计肽中,抗菌肽LRpG凭借其最优的结构参数平衡,对革兰氏阴性菌表现出最佳的平均抗菌活性(GMMIC=3.5μM)和治疗指数(GMTI=73.14)。此外,环境敏感性分析及联合药敏试验结果显示,抗菌肽LRpG具有较好的盐离子、温度、pH及血清耐受性,且与临床常用抗生素具有体外相加抗菌作用。
为了研究抗菌肽LRpG的抑菌机理,本研究利用荧光探针技术及电子显微观察技术检测了抗菌肽LRpG对细菌细胞膜完整性的影响,采用DNA凝胶阻滞试验及ROS聚集试验检测了抗菌肽LRpG对细菌基因组DNA的影响。结果显示,抗菌肽LRpG可通过细胞膜损伤作用和DNA结合作用杀死细菌,且以物理破膜作用为主。其杀菌过程为:抗菌肽LRpG首先穿透细菌细胞膜,破坏质膜完整性,引起内容物泄漏,随后进入细胞内部,与细菌基因组DNA结合,影响细菌正常生命活动,导致细菌死亡。
为了研究抗菌肽LRpG对细菌内毒素(LPS)的中和作用,本研究通过鲎试剂显色试验和LPS竞争性抑制试验证实抗菌肽LRpG对LPS具有较强的结合作用,且呈浓度依赖方式。在上述研究的基础上,为了进一步探究抗菌肽LRpG对LPS诱导炎症反应的抑制能力,本研究构建了LPS诱导的小鼠巨噬细胞炎症模型,并使用小鼠细胞因子ELISA试剂盒测定抗菌肽LRpG对炎症介质释放的影响。结果显示,抗菌肽LRpG能够以浓度依赖的方式抑制炎性介质TNF-α、NO、IL-6及IL-1β的过量释放。
为了降低成本并大量获得具有较高治疗指数的抗菌肽LRpG,本研究选用原核表达系统对其进行串联表达。根据大肠杆菌密码子偏嗜性,设计并合成抗菌肽LRpG的4倍串联体基因,采用同尾酶串联法构建多基因串联体nLRpG(n=4、8、12或16),随后将上述片段分别连接到pET-32a(+)表达载体中,成功构建pET-32a-nLRpG(n=4、8、12或16)重组表达质粒。经IPTG诱导表达后,利用亲和层析技术,成功获得16LRpG融合蛋白。采用羟胺专一性裂解及高效液相纯化技术成功获得LRpG单体,其生物学活性和二级结构均与化学合成法制备的抗菌肽LRpG一致。