论文部分内容阅读
系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）是一种导致全身多个器官免疫损伤的慢性自身免疫性疾病,其特点是异常的淋巴细胞活化、高滴度自身抗体的产生,引起补体的激活、免疫复合物广泛沉积。这种疾病在亚洲人群中尤其是在中国的高海拔地区更为普遍,患者的生存质量相对较差,且对家庭和社会造成了严重的负担。虽然SLE已有相对成熟的治疗体系,但是目前SL E的发病机制还尚不明确,维持B细胞稳态、控制B细胞过度活化和降低耐受能力受损至关重要,需要更多的临床数据和实验来提供指导。miRNA是一类长度为19-24个碱基非编码保守的RNA,在真核生物中大量存在,可通过调控下游靶基因mRNA的3’UTR来直接抑制mRNA的功能或是直接促进mRNA的降解。miRNA可参与调控机体近三分之一靶基因的表达、转录、翻译和修饰等过程,对机体的发育、细胞的增殖凋亡都有着重要的生物学功能。越来越多的证据显示,miRNA参与的调控机制是基因表达水平调控的重要方式,在系统性红斑狼疮的发病过程中,多种miRNA与病情的活动度相关。miRNA在SLE中的作用可能会成为很有价值的生物学标记物,为SLE的诊断和治疗提供更多的帮助。且miRNA-150-5p和STAT1被报道在SLE中存在差异性表达,但是目前还没有关于miR-150-5p和STAT1调控轴对SLE发病的研究。本课题旨在阐明SLE中差异性表达的miRN A以及miR-150-5p调控STAT1的表达影响SLE中B细胞的活化。[目 的]筛选文献中关于系统性红斑狼疮差异性表达且可作为生物学标记物的miRNAs;筛选SLE患者外周血中差异性表达的miRNAs;预测并探讨mi R-150-5p和STAT1的生物学功能;验证miR-150-5p调控STA T1影响B细胞活化的生物学机制。[方法]通过荟萃分析的方法对miRNA、SLE和biomarker进行分析检索筛选;收集15例SLE患者和15例健康对照组的外周血,通过PCR技术对荟萃分析结果中特异性和敏感性较强的几个miRNA进行验证;通过生物信息学分析,筛选出多数据库中差异性的miRNA以及下游靶基因,且进行GO和KEGG的富集分析;随后收集3例活动期的SLE患者和3例健康对照者的外周静脉血,通过二代测序技术筛选PBMC中具有显著差异的miRNAs,通过GO和KEGG分析显著差异的miRNA和差异性基因,与之前的所有结果进行比对分析,得到目的m iRNA;通过TargetScan、RNA22、miRB ase和PITA等miRNA数据库预测下游靶基因;在MRL/lpr小鼠体内通过PCR、流式细胞分析、Western blot、ELISA、补救实验和荧光素酶报告基因实验验证miR-150-5p调控STAT1的影响B细胞的活化。[结果]对符合标准的11篇文献中的30个miRNA进行荟萃分析发现,17个上调的miRNAs和13个下调的miRNAs,或许可作为SLE的诊断性生物标记物,其中miR-20a和miR-16的最高敏感性为0.98（CI 0.89-1.00）;miR-221-5p、miR-380-3p、miR-556-5p、miR-758-3p、miR-3074-3p组合计算的敏感性也为0.98（CI 0.87-1.00）,miR-16、miR-15b和miR-150的特异性也均为0.95（CI 0.75-1）。通过P CR我们对15例SLE患者和15例健康对照组的外周血进行检测,发现8个miRNA s（miR-150-5p、miR-16、miR-20a、miR-15b、miR-146a、miR-155、miR-23a和miR-223）存在显著差异（P＜0.05）,其中miR-233为上调,其余miRNAs为下调。PBMC转录组测序后发现10个差异性表达的miRNA,其中包括3个下调的miRN As和7个上调的miRNAs,miR-150-5p是显著下调的miRNA之一。富集分析得到差异性表达的miRNA与炎症、细胞表面抗体、多条免疫相关通路有关,Targ etscan预测发现STA T1受到miR-150-5p的调控。MRL/lpr小鼠中miR-150-5p的表达量明显低于对照组（P＜0.01）,其靶基因STA T1的表达量明显高于对照组（P＜0.05）,符合预期;MRL/lpr组小鼠脾脏与正常小鼠相比,明显增大（P＜0.05）;经miR-150-5p agomir注射的小鼠,脾脏相比NC组减小,而miR-150-5p antagom ir组小鼠脾脏增大;MRL/lpr组小鼠血液和脾脏中B细胞比正常小鼠明显增多（P＜0.001）,miR-150-5p agomir组小鼠,血液中B细胞相比NC组减少（P＜0.001）,而miR-150-5p antagomir组小鼠B细胞明显增多（P＜0.001）;相比与对照组,mo del组IgG、anti-ds-DNA、ANA、IL-6、IL-12的表达水平显著提高（P＜0.05）,C 3的表达水平显著下降（P＜0.05）,当miR-150-5p agomir干预后可以缓解SLE小鼠的体内的炎性反应;HE及PAS染色结果显示,MRL/lpr小鼠的肾脏病理变化在注射agomir后有一定的缓解,而antagomir的注射可一定程度的加重;PCR、W estern blot和荧光素酶报告基因实验结果证明miR-150-5p可以调控STAT1的表达。[结 论]miRNA可以参与到SLE的发生与发展;在SLE中miR-150-5p为低表达,STAT1则为高表达,miR-150-5p可通过与STAT1的3’UTR结合促进STA T1的降解,使得STAT1的表达、转录和翻译过程降低,进而抑制B细胞的活化,控制SLE的病情发展,且miR-150-5p的表达水平或许可以成为SLE早期诊断和治疗的生物标记物。