帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是严重影响患者生活质量的第二大常见的神经退行性疾病。目前,仍然缺乏有效的治疗能延缓或阻止PD的进展。因此,深入探索PD的发病机制尤为重要。本研究以SH-SY5Y、PC12细胞和SD大鼠为实验对象,研究鱼藤酮（ROT）诱导的PD体内和体外模型中自噬的变化及其发生机制,深入探索PD模型中TMEM230介导巨自噬以及分子伴侣介导自噬（CMA）的调控作用,以及TMEM230-A110T突变在线粒体分裂融合动态平衡中的作用及其调控机制,以期为PD的神经保护治疗提供新的思路。第一部分鱼藤酮诱导的自噬对帕金森病模型多巴胺能神经元退变的影响[目的]本研究旨在建立ROT诱导的PD细胞和动物模型,研究ROT诱导的PD模型中自噬水平的变化,探讨自噬在ROT诱导的PD模型中的作用。[方法]（1）体内实验:模型组SD大鼠连续颈背部皮下注射ROT28天构建PD大鼠模型,Vehicle组大鼠颈背部皮下注射等量的葵花油。注射结束后的第2天进行转棒实验和旷场实验。随后,收集各组大鼠中脑和纹状体进行实验。免疫组化观察黑质和纹状体中酪氨酸羟化酶（TH）的表达,同时免疫荧光观察TH、α-syn的表达,进一步验证ROT诱导的PD大鼠模型是否成功建立。免疫印迹法（WB）和免疫荧光观察自噬标志蛋白LC3和自噬底物蛋白P62的表达。同时,WB检测cleavedcaspase-3、Bax、Bcl-2等凋亡相关蛋白。Tunel染色检测细胞凋亡情况。尼氏染色检测尼氏小体,观察神经元密度。（2）体外实验:不同浓度的ROT处理SH-SY5Y/PC12细胞,选择最佳PD造模浓度。检测ROT干预24h后的SH-SY5Y/PC12细胞存活率,以及线粒体膜电位、活性氧（ROS）、ATP水平。以最佳ROT造模浓度处理细胞,在不同时间点（0h、3h、6h、12h、24h）采用WB检测α-syn的表达以及P62和LC3Ⅱ蛋白表达水平,同时观察CMA相关蛋白（LAMP2A、HSC70）和凋亡相关蛋白的表达。[结果]（1）体内实验:ROT干预的大鼠（ROT组）表现出明显的体重减轻、运动不稳和驼背姿势。旷场实验提示与Vehicle组相比ROT组大鼠的运动距离、平均速度和运动时间均明显减少（P＜0.05）;转棒实验中ROT组转棒上停留时间缩短（P＜0.05）。与Vehicle组相比,ROT组大鼠纹状体和黑质的免疫组化和免疫荧光发现TH阳性的细胞数和阳性纤维数显著下降（P＜0.05）,α-syn平均绿色荧光强度明显增加（P＜0.05）。与Vehicle组相比,WB结果显示ROT组 Bax、cleaved-caspase3 增加,Bcl-2 下降（P＜0.05）。此外,与 Vehicle 组相比尼氏染色发现ROT诱导PD大鼠纹状体内尼氏小体数量减少,形态欠佳,大小不一。（2）体外实验:ROT能够诱导SH-SY5Y/PC12细胞的细胞存活率明显下降,线粒体膜电位下降,ROS含量增加,ATP水平明显下降。同时,ROT诱导下α-syn蛋白水平明显增加（P＜0.05）,伴有LC3Ⅱ下降,P62升高,提示自噬抑制;LAMP2A及HSC70逐渐下降（P＜0.05）,提示CMA途径受损;在ROT干预下Bax、cleaved caspase-3增加,Bcl-2下降,提示神经细胞凋亡增加（P＜0.05）。此外,自噬激活剂雷帕霉素（rapamycin）预处理可显著降低ROT上调的caspase3、Bax、P62 水平（P＜0.05）,升高 LC3Ⅱ水平,提示 rapamycin 能逆转ROT导致的自噬抑制和凋亡。[结论]ROT能成功的诱导建立PD的体内、体外模型。同时,ROT能诱导PD模型中巨自噬和CMA途径障碍,并可能是多巴胺能神经元凋亡的原因。第二部分TMEM230在鱼藤酮诱导的帕金森病模型中对自噬的调控作用[目的]探索TMEM230调控ROT诱导的SH-SY5Y细胞和PD大鼠多巴胺能神经元的自噬-溶酶体途径的机制。[方法]（1）体内实验:用脑立体定位仪在大鼠左侧纹状体注射shTMEM230慢病毒（shTMEM230+ROT组）和阴性对照病毒（shNC+ROT组）,注射一周后予ROT连续干预28天。2天内完成行为学检测。免疫组化评估黑质和纹状体内TH 阳性细胞数和阳性纤维数,免疫荧光评估TH和α-syn的表达。免疫荧光双标记检测 LAMP2A 和 LAMP1,TMEM230 和 UCH-L1 以及 TMEM230 和 LC3Ⅱ 的表达。WB 检测 P62、LC3Ⅱ、Bax、Bcl-2、PARP1 的表达。（2）体外实验:TMEM230过表达慢病毒（OE-TMEM230组）和对照病毒（OE-NC组）、TMEM230敲低慢病毒（sh-TMEM230组）和对照慢病毒（sh-NC组）分别处理SH-SY5Y细胞,WB 检测 ROT 干预和不干预下 P62、LC3Ⅱ、caspase3、Bax、Bcl-2、PARP1 的表达。尼氏染色检测两组尼氏小体数量和形态。Tunel染色检测细胞凋亡情况。电镜观察自噬小体和溶酶体。此外,WB方法检测可能调控自噬的相关通路mTOR、p-mTOR、ERK1/2、p-ERK1/2、Beclin1、AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K等相关蛋白。[结果]（1）体内实验:与shNC+ROT组相比,shTMEM230+ROT组大鼠更早出现运动迟缓、反应迟钝等PD类似的行为学表现。旷场实验中shTMEM230+ROT组大鼠总运动距离、平均速度和站立次数明显减少,而静止时间明显增加（P＜0.05）。爬杆实验显示shTMEM230+ROT组大鼠在转棒上停留时间较NC+ROT组明显下降（P＜0.05）。免疫荧光发现shTMEM230组中TH平均荧光强度显著下降,而α-syn明显升高（P＜0.05）。WB发现同样的结果（P＜0.05）。荧光显微镜观察到纹状体内条索状或点状的聚集物（类似LBs）中α-syn和TMEM230共定位。与shNC组相比shTMEM230敲低组大鼠左侧纹状体内尼氏小体数量明显减少,形态发生改变,提示神经元受损增加。Tunel染色提示shTMEM230慢病毒注射左侧纹状体后,左侧纹状体内凋亡细胞数较shNC+ROT组进一步增加。PD动物模型中TMEM230敲低导致P62蛋白水平升高（P＜0.05）。荧光显微镜观察到纹状体内TMEM230与LC3Ⅱ荧光共定位,且TMEM230敲低组LC3Ⅱ荧光强度也下降（P＜0.05）。在TMEM230敲低的PD大鼠纹状体内观察到LAMP1和LAMP2A蛋白水平均下降（P＜0.05）,提示溶酶体功能受损和CMA途径受到抑制。同时,TMEM230敲低诱导PD模型中cleaved caspase-3、Bax及PARP1升高,Bcl-2下降（P＜0.05）。此外,在PD大鼠模型中,shTMEM230+ROT组左侧纹状体Beclin1蛋白水平下降,ERK1/2磷酸化水平明显升高（P＜0.05）,ERK1/2、mTOR、p-mTOR、AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K蛋白水平无明显差异（P＞0.05）。（2）体外实验:WB发现TMEM230敲低的SH-SY5Y细胞中DAT蛋白水平下降,α-syn明显升高（P＜0.05）,TMEM230过表达则相反。TMEM230敲低的SH-SY5Y细胞在ROT刺激下P62明显升高,LC3Ⅱ表达下降,过表达时相反。电镜结果显示shNC组线粒体损伤程度较shTMEM230组略低,shNC组内可见少量自噬,其自噬水平高于shTMEM230组。进一步研究发现在细胞和动物模型中TMEM230敲低显著诱导PARP1增加和caspase 3激活（P＜0.05）,这两个分子均诱导细胞凋亡。TMEM230敲低的细胞模型中cleaved caspase-3、Bax 及 PARP1 升高,Bcl-2 下降（P＜0.05）,而 TMEM230 过表达的PD细胞模型中相反。此外,Beclin1和p-ERK1/2蛋白蛋白的表达与体内实验结果一致（P＜0.05）。[结论]TMEM230基因敲低加剧PD大鼠模型的类似PD的运动障碍,同时在ROT诱导下TMEM230敲低加剧体内、体外模型的自噬-溶酶体功能障碍,加重多巴胺神经元凋亡。TMEM230敲低引起的这种自噬障碍可能通过ERK1/2/Beclin1调控,并不依赖mTOR途径。第三部分TMEM230介导UCH-L1调控自噬在帕金森病模型中的作用及机制研究[目的]阐明TMEM230和UCH-L1的相互作用关系以及其调控机制,进一步明确TMEM230是否通过UCH-L1调控自噬参与PD的发病机制。[方法]分为空载体细胞转染组和TMEM230-Flag转染组分别转染细胞,进行CO-IP质谱检测。IP实验进一步明确TMEM230和UCH-L1的关系。免疫荧光观察TMEM230、UCH-L1的表达。WB检测细胞和动物模型中UCH-L1蛋白的表达。UCH-L1 siRNA（siUCH-L1）和 NC siRNA（siNC）分别转染 TMEM230过表达慢病毒处理的SH-SY5Y稳定细胞株（OE-TMEM230）和阴性对照慢病毒转染的SH-SY5Y稳定细胞株（OE-NC）。PCR检测siUCH-L1转染效率,WB检测进一步检测 P62、LC3Ⅱ、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、PARP1 的表达。[结果]免疫共沉淀证实TMEM230和UCH-L1存在互作关系。动物实验中,免疫荧光发现在大鼠纹状体和黑质中可以观察到TMEM230和UCH-L1共表达,且在ROT刺激下TMEM230和UCH-L1表达均下降（P＜0.05）。WB实验也可以得到同样的结果（P＜0.05）。同时,WB实验和免疫荧光证实shTMEM230+ROT组左侧纹状体内UCH-L1明显下降（P＜0.05）。细胞实验中OE-TMEM230组UCH-L1表达升高（P＜0.05）,而TMEM230敲低的SH-SY5Y细胞中UCH-L1表达下降（P＜0.05）。以上结果提示TMEM230正调控UCH-L1蛋白的表达。WB结果显示在转染OE-NC慢病毒的SH-SY5Y稳定细胞中,UCH-L1敲低能导致P62升高,LC3Ⅱ下降（P＜0.05）,提示UCH-L1敲低能抑制自噬。更有趣的是,UCH-L1敲低能逆转OE-TMEM230组导致的LC3Ⅱ升高和P62下降（P＜0.05）,并伴有 BAX、Cleaved caspase-3 蛋白表达增加（P＜0.05）。[结论]TMEM230与UCH-L1呈正调控关系,UCH-L1敲低能逆转TMEM230过表达导致的自噬激活,导致神经元细胞凋亡增加。因此,TMEM230通过UCH-L1调控自噬参与PD的发病机制。第四部分TMEM230-A110T突变介导的线粒体分裂/融合在ROT诱导的PD模型中的作用和机制研究[目的]探讨TMEM230-A110T突变在ROT诱导的SH-SY5Y细胞中线粒体分裂/融合的机制。[方法]TMEM230-A110T、TMEM230-WT、NC三种慢病毒分别转染SH-SY5Y细胞。检测不同组别的ROS水平以及线粒体红色荧光探针。WB检测PINK1、Parkin以及线粒体融合/分裂相关蛋白（Fis1、Drp1、p-Drp1、MFN1及MFN2）的表达。[结果]ROT诱导SH-SY5Y细胞线粒体膜电位降低,活性氧水平增加。同时,在ROT诱导下SH-SY5Y细胞p-Drp1、Fis1、MFN2、MFN1蛋白水平明显升高（P＜0.05）。然而,ROT诱导Pink1/Parkin蛋白水平却出现表达下降的趋势,与对照组相比具有显著性差异（P＜0.05）。A110T突变的SH-SY5Y细胞在ROT暴露下增加了 ROS的蓄积（P＜0.05）,降低了线粒体红色荧光探针平均荧光强度（P＜0.05）,TMEM230-WT 组则相反。TMEM230-A110T 组较NC 组相比 Fis1及p-Drp1呈上升趋势（P＜0.05）,而Pink1、Parkin及MFN2蛋白表达明显下降（P＜0.05）。相反,ROT刺激下WT组中Fis1和p-Drp1蛋白水平表现出相反的趋势,p-Drp1和Fis1蛋白水平降低（P＜0.05）,MFN2、MFN1与NC组相比无显著差异（P＞0.05）。[结论]TMEM230-A110T在ROT刺激下调控PINK1、Parkin蛋白,同时促进线粒体分裂,降低线粒体融合。结合既往研究报道Pink1/Parkin对MFN2和Drp1的调控作用,我们推测MFN2和Drp1可能位于PINK1或是Parkin蛋白的下游,TMEM230-A110T可能通过PINK1和Parkin调控着线粒体分裂/融合作用,调控线粒体的质量和维持着线粒体稳态。但仍需进一步的大量研究进行验证。