以获得绵羊肌肉特异的启动子miRNA双表达载体为目标,我们以绵羊基因组DNA为模板,用PCR方法扩增得经生物信息学分析正确的绵羊的肌肉生长抑制素(myostatin, MSTN)启动子序列并对绵羊MSTN启动子进行了转录结合位点的分析；通过构建携带Myostatin基因启动子(Pro)序列特异性报告载体pEGFP-MSTN,转染羊肌卫星细胞和羊成纤维细胞,研究绵羊Myostatin基因的启动子(Pro)能否驱动报告基因在羊肌卫星细胞和成纤维细胞中表达及表达特异性。结果表明,pEGFP-MSTN仅在羊肌卫星细胞中表达,在成纤维细胞中不表达,然而携带CMV启动子的pEGFP-N1阳性对照质粒转染羊肌卫星细胞和羊成纤维细胞后,均能驱动报告基因在羊肌卫星细胞中表达和在成纤维细胞中表达。这表明Myostain基因表达的肌肉特异性源于启动子的特异性,这将为后续肌肉特异miRNA双表达载体构建奠定基础。以获得：miRNA筛选报告载体poMSTN-EGFP为目标,我们以绵羊或山羊肌肉组织提取总RNA为模板,用RT-PCR扩增得经生物信息学分析正确的绵羊MSTNcDNA序列；将序列正确的cDNA克隆入pEGFP-Nl的Xhol/BamHI位点,获得miRNA筛选报告载体poMSTN-EGFP,将pEGFP-N1和poMSTN-EGFP报告载体分别转染小鼠成纤维细胞,用荧光观察和RT-PCR检测:miRNA筛选报告载体poMSTN-EGFP在小鼠成纤维细胞中能否正确表达。结果表明,携带CMV启动子的pEGFP-N1阳性对照质粒和poMSTN-EGFP均能驱动报告基因在小鼠成纤维细胞中表达,并通过RT-PCR检测到融合基因的表达。这将为筛选有效抑制绵羊MSTN基因的1niRNA分子奠定基础。肌肉生长抑制素是肌肉生长的负调控因子。本研究为了得到有效抑制绵羊MSTN基因的miRNA分子,设计5对miRNA寡聚核苷酸引物,经退火合成5个shRNA,将其克隆入miRNA表达载体pcDNA5-miR,构建:miRNA真核表达载体,将miRNA真核表达载体与poMSTN-EGFP报告载体共转染3T3细胞。结果显示,5条：miRNA分子中均对MSTN基因有显著的抑制作用,其中pcDNA5-miR-shRNA364,pcDNA5-miR-shRNA369对MSTN干扰效果较好,这将为后期定量分析pcDNA5-miR-shRNA364, pcDNA5-miR-shRNA369对MSTN干扰效果奠定基础。