【摘 要】
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目的:克隆和表达结核分枝杆菌(MTB)磷酸盐特异性转运系统蛋白1(PstS1),分析其免疫学活性,评价其诊断结核病的价值。方法:根据Genbank中报道的MTB H37Rv株PstS1基因序列设计引
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目的:克隆和表达结核分枝杆菌(MTB)磷酸盐特异性转运系统蛋白1(PstS1),分析其免疫学活性,评价其诊断结核病的价值。方法:根据Genbank中报道的MTB H37Rv株PstS1基因序列设计引物,PCR扩增目的基因,与克隆载体pMD18-T连接,转化至宿主菌E.coli JM109,菌落PCR和质粒DNA测序鉴定阳性克隆。将双酶切的PstS1基因与表达载体pET-28a(+)连接,转化至宿主菌E.coli JM109,筛选阳性重组子,提取pET-28a(+)-PstS1重组表达质粒,经PCR和双酶切鉴定后,转化至宿主菌E.coli BL21(DE3);IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定表达产物。亲和层析纯化PstS1,Western-blot鉴定其反应原性。棋盘滴定法确定PstS1与病人血清反应的最适浓度。以PstS1作为诊断抗原,ELISA检测结核病患者血清抗体,评价其诊断价值。结果:PCR扩增得到PstS1基因,大小约1120bp,经DNA测序鉴定其与MTB标准菌株PstS1基因序列一致。成功构建重组表达质粒pET-28a(+)-PstS1,经IPTG诱导表达得到PstS1,亲和层析得到纯化的PstS1。Western-blot证实PstS1具有良好的反应原性。棋盘滴定法确定PstS1最适反应浓度为0.5μg/100μL,最适血清稀释度为1:100。PstS1的ELISA诊断结核病的灵敏度为85%,特异性为94.9%,阳性及阴性预测值分别为94.2%和86.2%,诊断效率为89.9%。结论:采用重组DNA技术获得有免疫学活性的PstS1,可用于结核病的诊断。
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