【摘 要】
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牛围产期能量负平衡（NEB）状态和雌激素（17β-雌二醇,E2）异常波动导致的中性粒细胞（PMN）功能障碍与围产期疾病易发密切相关,而细胞能量状态是维持PMN正常功能的基础。但在围产期NEB所形成的低糖微环境中,E2对PMN能量状态的影响及具体调节机制尚不清楚。本研究选用西门塔尔卵巢摘除牛3头,采用颈静脉穿刺采血、Percoll密度梯度法分离获得PMN,用于以下试验。旨在通过评价E2对体外牛循环P
【基金项目】
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国家自然科学基金（31260626,31760752）；
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牛围产期能量负平衡（NEB）状态和雌激素（17β-雌二醇,E2）异常波动导致的中性粒细胞（PMN）功能障碍与围产期疾病易发密切相关,而细胞能量状态是维持PMN正常功能的基础。但在围产期NEB所形成的低糖微环境中,E2对PMN能量状态的影响及具体调节机制尚不清楚。本研究选用西门塔尔卵巢摘除牛3头,采用颈静脉穿刺采血、Percoll密度梯度法分离获得PMN,用于以下试验。旨在通过评价E2对体外牛循环PMN的能量状态和细胞代谢途径的调节作用,探究牛围产期NEB状态下E2调节PMN能量代谢的潜在机制。（1）将PMN置于低糖（2.5 m M）和正常糖（5.5 m M）培养,并分别用E2（0、20、200和450 pg/m L）诱导0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h。经细胞活力检测（CCK-8法）发现,E2具有浓度依赖性（0～450 pg/m L）的细胞保护作用（P＜0.01）,在诱导6 h时保护特征最显著（P＜0.01）,故下游试验选用450 pg/m L E2诱导细胞6 h。（2）低糖条件下用450 pg/m L E2诱导PMN 6 h,自噬与凋亡蛋白（Western Blot法）检测发现,低糖时E2增强自噬蛋白LC3、p62和Beclin1的表达（P＜0.01）,提高凋亡蛋白Bcl-2/Bax的比率（P＜0.01）。这表明E2能够通过促进自噬、抑制凋亡抵抗低糖应激诱导的细胞活力的下降。（3）低糖条件下LPS诱导PMN 6 h,检测细胞内糖原含量（生物化学法）、ATP含量（ELISA法）和凋亡率（流式细胞术）发现,E2在低糖和LPS诱导后抑制GSK-3β活性和PMN凋亡（P＜0.05）,提高糖原和ATP含量（P＜0.05）。这表明,E2通过抑制GSK-3β活性维持细胞糖原和ATP含量,减缓细胞低糖应激负效应。（4）利用能量代谢途径相关抑制剂评价E2在低糖和LPS条件下对细胞代谢状态和代谢途径特征的影响。能量代谢途径相关酶（ELISA和生化法）检测显示:在低糖和LPS刺激时,2-DG（糖酵解抑制剂）抑制PFK1活性降低糖原和ATP含量（P＜0.01）;6-AN（磷酸戊糖途径抑制剂）抑制G6PDH活性增强糖原含量（P＜0.01）,但ATP含量不变;Oligomycin A（氧化磷酸化抑制剂）、TFA（三羧酸循环抑制剂）、etomoxir（脂肪酸氧化抑制剂）和BPTES（谷氨酰胺抑制剂）降低ATPS、CS、CPT-1活性和谷氨酰胺含量（P＜0.05）,增强糖原含量、降低ATP生成（P＜0.05）,但而E2可逆转这种趋势,增加ATP和糖原含量（P＜0.05）。提示磷酸戊糖途径、线粒体和谷氨酰胺代谢可能决定低糖应激状态下PMN的糖原含量。PMN通过糖酵解、线粒体代谢以及谷氨酰胺代谢为细胞提供ATP,而磷酸戊糖途径对ATP相对贡献较低。E2可以通过PMN能量代谢转换为细胞提供ATP和糖原。低糖显著降低静息PMN的PFK1活性和谷氨酰胺含量（P＜0.01）,显著提高G6PDH、ATPS、CS和CPT-1活性（P＜0.05）,而E2也降低PFK1和G6PDH活性（P＜0.01）,增强ATPS、CS和CPT-1活性,但增强了谷氨酰胺含量（P＜0.05）。表明,E2能够增强低糖环境中静息PMN的谷氨酰胺和线粒体代谢（氧化磷酸化、脂肪酸氧化和三羧酸循环）,抑制糖酵解和磷酸戊糖途径,促进糖原储存和ATP产生;激活PMN后,PFK1、G6PDH活性和谷氨酰胺含量升高（P＜0.01）,ATPS、CS和CPT-1活性降低（P＜0.05）;而E2降低PFK1和G6PDH活性及谷氨酰胺含量（P＜0.01）,增强ATPS、CS和CPT-1活性（P＜0.05）。表明E2通过改变激活的PMN从线粒体代谢向葡萄糖代谢和谷氨酰胺代谢途径的转换,抑制糖原分解促进ATP生成。综上本研究发现,E2能够增强低糖环境中PMN的谷氨酰胺代谢和线粒体代谢,抑制葡萄糖分解代谢（糖酵解和磷酸戊糖途径）,同时逆转激活的PMN从线粒体代谢向葡萄糖代谢和谷氨酰胺代谢的转换;E2通过抑制GSK-3β活性和促进自噬,提高细胞糖原含量,发挥维持低糖应激状态下PMN细胞存活和免疫潜能的作用。
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