论文部分内容阅读
本文研究螺旋藻对刀豆氨酸(CS)和不同抗生素的耐受性和敏感性；提取螺旋藻抗CS突变株A9c的基因组DNA转化野生藻株A9,获得同源转化螺旋藻的参数组合；构建含有螺旋藻A9启动子的外源质粒载体p215t-spp,并将其转入螺旋藻A9,实现绿色荧光蛋白GFP在螺旋藻细胞内的稳定表达。本研究初步建立了一套螺旋藻遗传转化操作系统,可为螺旋藻转基因操作提供重要技术参考。
Chl、Str对螺旋藻均有很强的抑制作用,在液体培养条件下,1.0μg·ml-1的Chl、3μg·ml-1的Str对螺旋藻有完全的致死作用；固体培养条件下,1.2μg·ml-1的Chl、4μg·ml-1的Str可完全抑制螺旋藻在固体平板上的生长。Amp对螺旋藻有较强抑制作用,液体培养时Amp对螺旋藻的MIC为100μg·ml-1;固体培养时Amp对螺旋藻的MIC约为200μg·ml-1。螺旋藻对Km很不敏感,在600μg·ml-1 Km的液体培养基中,螺旋藻的生长完全不受抑制。Chl、Str和Amp均适合作为螺旋藻的抗性筛选标记,筛选浓度分别为：1.2μg·ml-1、4μg·ml-1、200μg·ml-1。
将螺旋藻抗CS突变株A9c的基因组DNA作为材料转化野生藻株A9,以30μg·ml-1的CS作为筛选压力,获得了转化藻株,得到了一些同源转化的参数：在低于最适生长温度的条件下(24℃)培养螺旋藻；转化前用2mmol·L-1的EDTA预处理24h;利用超声波对螺旋藻进行处理,功率为300w,处理时间为70s;采用自然转化方法,冰浴处理,避光条件下液体培养后涂平板,筛选转化子。
本实验以构建的携带gfp基因的质粒p215t-spp和出发质粒p215t作为载体,分别采用冰浴法和PEG融合法转化螺旋藻A9藻株,成功实现了gfp基因在螺旋藻株中的表达。比较了用不同质粒在相同条件下转化A9藻株的转化率,数据显示p215t-spp可以比p215t极显著提高转化率(a=0.01),初步证明采用螺旋藻的启动子构建质粒可以提高转化效果；比较了相同质粒用不同方法转化A9藻株的转化率,数据显示采用适当浓度的PEG可以有效的提高转化率。经过反复实验证明,采用1％的PEG浓度作用30min可以获得较高转化率(10.5‰)。对转化藻株进行荧光检测,藻丝段在390nm蓝光激发下发出绿色荧光,证实gfp基因在转化藻株中得到有效表达。连续观察转化藻株荧光发光情况发现,转化藻株转接3次后均可观察到绿色荧光,证明了gfp基因成功实现了在螺旋藻细胞内的稳定表达。