T-2毒素杂交瘤细胞株的选育及免疫检测技术研究

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近年来国内外食品安全问题频繁发生,由真菌毒素污染引发的食品安全事件备受关注。单端孢霉烯族毒素是由寄生在多种农作物上的镰刀菌属霉菌在一定条件下产生的一类倍半萜烯类化合物,根据化学结构的不同可以分为A、B、C、D四类。T-2毒素属于这类化合物中的A族,是单端孢霉烯族毒素污染水平较高、毒性最强的毒素之一,其对不同谷物均有一定程度的污染,尤其是对小麦、玉米、燕麦、大麦和稻谷,在低温地区或潮湿的环境中更易发生。动物实验表明,T-2毒素不仅显示较为强烈的血液毒性和免疫抑制毒性,而且还能够抑制蛋白质和DNA、RNA的合成。因此为了减小T-2毒素对人类和动物健康的不良影响,控制由真菌毒素污染造成的风险,保障农产品和食品消费安全,对食品和饲料中的T-2毒素进行必要的检测监控是一种非常实用有效的方法。鉴于T-2毒素污染的广泛性及对人和动物健康产生的巨大危害,世界各国在制定严格的T-2毒素限量标准的基础上,同时也建立了各种不同的检测分析方法。理化方法如TLC、HPLC、HPLC-MS等,但这些方法有的灵敏度低,特异性差;有的设备昂贵,操作复杂,检测时间长,很大程度上制约了T-2污染检测监控工作的开展。基于单克隆抗体的免疫分析方法,简单快速、一步式操作、结果肉眼可见,适用于现场如农场、粮仓等大批量农产品和饲料样品的快速筛查。本论文的主要研究内容如下:1.制备出高质量的T-2毒素完全人工抗原。合理的抗原设计与合成是获得高特异性高灵敏度单克隆抗体的基础和前提。T-2毒素作为小分子物质,不具有免疫原性,不能引起机体产生免疫反应,必须将其与载体蛋白偶联,参照文献方法,本研究选择戊二酸作为连接臂将其与载体蛋白偶联。首先将T-2毒素与戊二酸酐在吡啶催化作用下反应生成T-2-HG中间体, TLC结果显示,大部分T-2毒素已转化为T-2-HG;然后采用活泼酯法将T-2-HG中间体和载体蛋白BSA/OVA共价偶联(紫外扫描结果显示偶联成功),成功获得免疫原和检测原。高质量完全人工抗原的合成为小鼠免疫和杂交瘤细胞株的筛选奠定了基础。2.研制出T-2毒素高特异性、高灵敏度单克隆抗体。高质量抗体是建立免疫分析方法的关键。利用合成的人工抗原免疫小鼠,采用间接非竞争ELISA法测定小鼠抗血清的效价,结果显示免疫效果较好。取免疫小鼠的脾脏细胞和骨髓瘤细胞,通过细胞融合技术,采用改进的半固体培养基和两步筛选法共筛选到5株性能良好的单克隆细胞株,分别是4F12、2B5、2G7、1D7、4F3,其中2G7所分泌抗体的效价和灵敏度最高,且分泌抗体的性能稳定,抗体灵敏度(用IC50表示)为0.83ng/mL,而且与ZEN、AFB1、OTA、DON均无交叉反应或交叉反应率很低。采用辛酸硫酸铵法纯化2G7细胞株制备的腹水,纯化鉴定表明其纯化效果良好。
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