【摘 要】
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目的肝癌是临床上难治愈且易发生转移的癌症之一。羟基红花黄色素A（HSYA）是从草本植物红花中提取的、具有抗癌作用的水溶性物质,但HSYA抗肝癌的具体机制尚不明确。现探究HSYA抗肝癌的具体分子机制,为HSYA应用于临床治疗肝癌提供新思路。方法1.不同浓度的HSYA作用肝癌细胞24 h或48 h后,CCK8法检测细胞增殖率;2.流式细胞术检测HSYA作用肝癌细胞24h后的总凋亡率（早期凋亡+晚期凋亡
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目的肝癌是临床上难治愈且易发生转移的癌症之一。羟基红花黄色素A（HSYA）是从草本植物红花中提取的、具有抗癌作用的水溶性物质,但HSYA抗肝癌的具体机制尚不明确。现探究HSYA抗肝癌的具体分子机制,为HSYA应用于临床治疗肝癌提供新思路。方法1.不同浓度的HSYA作用肝癌细胞24 h或48 h后,CCK8法检测细胞增殖率;2.流式细胞术检测HSYA作用肝癌细胞24h后的总凋亡率（早期凋亡+晚期凋亡）;3.Western blot检测HSYA是否影响肝癌细胞的凋亡相关蛋白、自噬相关蛋白及PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白的表达;4.免疫荧光法观察HSYA作用肝癌细胞24 h后,自噬蛋白LC3的表达;5.透射电子显微镜观察HSYA是否改变肝癌细胞的超微结构;6.实时荧光定量PCR法检测HSYA对肝癌细胞ATG5表达的影响;7.mRFP-GFP-LC3腺病毒转染6 h后检测HSYA对肝癌细胞自噬流的影响;8.HSYA作用肝癌细胞24 h后,Lysotrack Red DND-99染色检测细胞溶酶体的酸性环境;9.裸鼠移植瘤模型:裸鼠皮下接种人肝癌细胞Huh7成功后,腹腔给药,每隔一天测一次肿瘤的长（a）和宽（b）,按公式V/mm3=ab2π/6计算肿瘤体积,停药后处死裸鼠并剥瘤,计算抑瘤率。HE染色观察组织的形态结构。免疫组化染色观察组织中目的蛋白（Ki67、LC3、p62、p-AKT和p-mTOR）的阳性表达。结果1.在一定给药范围内,HSYA能够抑制肝癌细胞增殖,促进细胞总凋亡率升高（P＜0.05）;Bax蛋白随HSYA浓度递增表达逐渐增加,Bcl-2和caspase3蛋白表达随HSYA浓度递增逐渐下降（P＜0.05）。2.HSYA诱导肝癌细胞自噬蛋白LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转换,LC3荧光蛋白表达量增加（P＜0.05）。在肝癌细胞的细胞质中,观察到双层膜包裹细胞器的自噬小体。此外,HSYA增加肝癌细胞ATG5的表达（P＜0.05）。3.HSYA诱导肝癌细胞p62蛋白表达量增加,溶酶体相关蛋白LAMP1表达量减少（P＜0.05）。mRFP-GFP-LC3腺病毒转染肝癌细胞显示,相较于对照组,HSYA作用肝癌细胞后,绿色荧光（GFP）增强,红色荧光（RFP:代表自噬溶酶体）增强,GFP/RFP比值升高（P＜0.05）;细胞的溶酶体酸性减弱（P＜0.05）。4.Western blot结果显示,HSYA作用肝癌细胞后,总AKT和总mTOR蛋白表达量与对照组一致,但p-AKT和p-mTOR蛋白的表达降低（P＜0.05）。5.裸鼠移植瘤实验结果:HSYA抑制裸鼠皮下肿瘤增殖。HE染色显示,对照组移植瘤组织呈团状分布,组织结构清楚,少量坏死肿瘤细胞;HSYA实验组出现细胞核固缩、深染、灶状坏死灶;此外,与对照组相比,HSYA实验组肝脏组织无明显病理学变化。免疫组化染色结果显示,与对照组相比,HSYA 1.125mg/kg组和HSYA2.25mg/kg组的LC3和p62蛋白阳性表达呈棕色且逐渐增强,p-mTOR、p-AKT和Ki67蛋白阳性表达逐渐减弱（P＜0.05）。结论1.HSYA能够抑制肝癌细胞增殖并促进细胞凋亡;2.HSYA可能是通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导肝癌细胞发生自噬反应,并生成自噬小体;3.HSYA通过损伤溶酶体的活性阻断自噬流,自噬小体积累不能降解,这可能是HSYA抑制肝癌细胞增殖、促进细胞凋亡的原因。
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