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自2010年以来,肺癌的靶向治疗取得了很大进展,出现了许多针对EGFR, MET, HER2, VEGF和ALK等靶点的小分子药物,尤其是针对EGFR的靶向药物在临床上显示了很好的疗效。但是仍有一部分患者耐药,难以从EGFR的靶向治疗中获益。这部分患者,细查原因,大部分是因为肿瘤细胞中存在KRAS突变[2],但往往还有其他基因女(?)PIK3CA和PTEN等基因的突变[3-5]。这些耐药的患者的治疗也成为了临床上的难点,本课题即致力于这一方面的研究。自80年代在人类肿瘤中检出突变KRAS以来,因其与人类肿瘤的密切关系而备受关注,关于它的文献数以万计。大部分以临床肿瘤标本为研究对象,也有以多种KRAS突变肿瘤细胞系为基础进行研究的。为探讨KRAS突变患者能否从小分子靶向治疗药物中获益,我们选用KRAS突变肺癌的肿瘤细胞模型进行实验。为了明确细胞资源中心所保藏的肿瘤细胞系中KRAS及相关的BRAF, EGFR, PIK3CA基因的突变情况,我们使用高分辨率溶解曲线技术(HRM)对库藏人类肿瘤细胞系进行突变的检测。首先,我们提取了173种肿瘤细胞的总DNA,根据以往文献报导KRAS、 PIK3CA、BRAF(?)(?)EGFR基因突变的热点所在的6个DNA片段,进行PCR扩增,获得高拷贝数的目标序列。然后进行高分辨率熔解。在时间和荧光的曲线上区分出野生型,突变杂合型和突变纯合型的细胞系。筛查结果显示在肿瘤细胞系中KRAS突变在所筛查的4个基因中最为常见,其中胰腺癌细胞系突变率为66.67%,结直肠癌细胞系为52.94%,肺癌细胞系为21.25%,是突变率最高的三种肿瘤细胞系,与文献报道的临床肿瘤患者中KRAS的突变频率相当：胰腺癌>80%,结直肠癌≈50%,肺癌10-30%[6] PIK3CA、BRAF、EGFR基因的突变在肿瘤细胞系中突变频率分别为14.45%、6.35%和4.62%。另外,我们还检测到了COC1、A875、SF767、TE671及PANC-1细胞系中的一些未见报导的基因突变情况。筛查结果明确了KRAS及相关基因在人类肿瘤细胞系中的突变情况,为开展肿瘤的靶向治疗研究提供了很好的模型。同时证明HRM技术是一种低成本,灵敏,特异和高通量的实验手段。根据前述突变检测结果,选择我们KRAS单突变的A549和KRAS/PTEN双突变的NCI-H157两株NSCLC细胞,观察两种信号通路抑制剂GDC-0941(PI3K/AKT/mTOR通路,PI3K抑制剂)和AZD6244(KRAS/RAF/MEK通路,MEK抑制剂)对不同突变的NSCLC细胞的用药效果。分别用不同浓度的GDC-0941和AZD6244单独或联合作用,MTT法初步观察对细胞增殖的影响。根据观察结果确定联合给药的浓度。设立无药对照组、P13K单独抑制组(GDC-0941,0.5/5.0μu mol/L)、联合Ⅰ组(0.5μ mol/L AZD6244+0.5μ mol/L GDC-0941)及联合Ⅱ组(5.0μ mol/L AZD6244+5.0μ mol/L GDC-0941)。细胞经过不同组合浓度的抑制剂作用后,MTT法绘制增殖抑制曲线；平板集落形成法检测集落形成能力的改变；流式细胞仪检测细胞凋亡率及周期分布；Western blot检测不同组中抑制剂靶点下游周期及凋亡相关蛋白表达的差异。在两株NSCLC细胞中,单独抑制RAS/RAF/MEK通路或PI3K/AKT/mTOR通路效果较差。抑制剂AZD6244或GDC-0941作用于A549细胞的抑制率分别可达25.5%和38.1%,作用于NCI-H157细胞的抑制率分别可达16.9%和35.1%。Westernblot结果显示AZD6244抑制RAS/RAF/MEK通路后(降低pERK活化)激活PI3K/AKT/mTOR通路(增强pAKT活化)。相反,GDC-0941抑制PI3K/AKT/mTOR通路后激活了RAS/RAF/MEK通路。结果表明单通路突变的细胞,仅抑制该突变通路,效果差。未突变通路的抑制剂对肺癌细胞的增殖也有抑制作用。无论肺癌细胞是KRAS单突变,还是KRAS/PTEN双突变,单通路抑制效果较差,需要双通路联合抑制提高疗效。RAS/RAF/MEK和PI3K/AKT/mTOR双通路联合抑制可增强KRAS/PTEN双突变的NSCLC细胞的生长抑制作用。在NCI-H157细胞中,低剂量的联合Ⅰ组表现为两药协同作用(q值=1.22),高剂量的联合Ⅱ组表现为两药相加作用(q值=0.92)；集落形成能力下降[77.2±1.54个/孔VS61.5±2.12个／孔,P<0.01]和[51±4个/孔VS22.5±3.53个/孔,P<0.01]；凋亡率增加[18.3±0.82%VS21.32±0.56%,P<0.01]和[27.14±1.58%VS42.45±4.42%,P<0.01]；细胞周期分布发生改变,联合抑制组G0/G1期细胞增加,S期明显减少(P<0.01)。Western blot显示,联合抑制组与P13K单独抑制组相比,CyclinD1, CyclinB1表达量减少,P21表达量和PARP剪切增加,Bcl-2/Bax的比值下降。表明双通路联合抑制,可降低剂量,增强药效。RAS/RAF/MEK和PI3K/AKT/mTOR双通路联合抑制亦可增强KRAS单突变的NSCLC细胞的生长抑制作用。但是由于两条通路的相互制衡作用,药效受两通路相对抑制情况的影响。在A549细胞中,联合Ⅰ组与低剂量的P13K单独抑制组相比,两抑制剂表现为拮抗作用(q=0.58),对肺癌细胞的增殖抑制作用未见增强,反而刺激了细胞的生长,集落形成能力[114.5±3.53个/孔VS133±4.24个/孔,P<0.01],细胞周期的分布及凋亡率无明显差异。联合Ⅱ组与高剂量P13K抑制组相比,两抑制剂表现为相加作用(q=0.90),细胞的增殖抑制作用出现了明显增强,集落形成能力明显下降[75.5±3.53个/孔VS50.5±4.94个/孔,P<0.01]；凋亡率显著增加[37.85±3.18%VS52.27±4.36%,P<0.01],细胞周期分布发生改变,联合抑制组G0/G1期细胞增加,S期明显减少(P<0.01)。Western blot显示,CyclinD1, CyclinB1表达量减少,PARP剪切增加,Bcl-2/Bax的比值下降。总之,RAS/RAF/MEK和PI3K/AKT/mTOR双通路联合抑制可使KRAS单突变和KRAS/PTEN双突变的NSCLC细胞的治疗获益,尤其是在KRAS/PTEN双突变NSCLC细胞中表现为协同作用。但是对于KRAS单突变NSCLC细胞,联合抑制效果受到药物剂量和相关信号通路中基因状态的影响。所有结果表明,在肺癌的个体化治疗时需检测信号通路上的多个基因的突变状态,联合信号通路小分子抑制剂的靶向治疗将使更多患者受益。