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糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(DM)重要的微血管并发症,主要病理特征是早期肾小球肥大,肾小球和肾小管基底膜增厚,系膜区细胞外基质进行性积聚;后期肾小球、肾小管间质纤维化,肾单位破坏,最终导致蛋白尿和肾功能衰竭。随着生活方式的改变,糖尿病的发病率一直呈增加趋势,DN导致的终末期肾病比例也逐年增高。DN发病机制复杂,至今未完全阐明,所以尚无完全有效的治疗措施。中医药作为一个较为有效地DN治疗措施,越来越被重视,中医药具有多靶点作用,故深入探讨中医药治疗DN的作用机制对于临床有重要指导意义。黄芪注射液和葛根素注射液在临床上常用于DM或DN的治疗,对于降低高血糖、改善高血脂以及保护DN患者的肾脏功能有良好的疗效,本实验通过研究黄芪注射液联合葛根素注射液治疗DN,旨在探讨两药合用对于DN肾脏保护作用的机理。目的:研究黄芪、葛根素注射液合用对改善糖尿病肾病BMP-7通路的影响,揭示益气生津中药治疗DN的作用机理。方法:1.将SPF级2型糖尿病模型KKAy小鼠分为模型组和黄芪注射液联合葛根素注射液组,同龄C57BL/J小鼠作为正常组。治疗组小鼠14周龄开始以腹腔注射的方式给药,隔周侧小鼠体重,测16、20、24周小鼠血糖。24周龄处死小鼠取小鼠肾脏观察肾组织病理形态学变化和BMP 7的mRNA.2.将人类肾小管上皮细胞(HK-2),分为正常组、模型组、黄芪注射液联合葛根素注射液治疗组。细胞贴壁后模型组加入含8ng/ml TGF-β1的完全培养基培养,治疗组加入含8ng/ml TGF-β1、黄芪注射液和葛根素注射液的完全培养基培养,48h后提取RNA做RT-PCR.另外在培养板上培养细胞,以每孔为一组,分组方法、处理方法同上,48h后做免疫组化染色。3.将HK-2细胞,分为正常组、模型组、黄芪注射液联合葛根素注射液治疗组SiRNA组和1ip2000对照组。细胞贴壁后模型组、治疗组处理方法同实验二,SiRNA组加入Smad5的SiRNA和lip2000转染剂转染后加入含8ng/ml TGF-β1、黄芪注射液和葛根素注射液的完全培养基培养,lip2000对照组只加入lip2000转染剂处理后加入含8ng/ml TGF-β1、黄芪注射液和葛根素注射液的完全培养基培养。48h后提取RNA做real-time PCR.结果:1.KKAy小鼠14周龄以后可出现明显的肥胖、高血糖;24周,肾脏病理改变可见肾小球基底膜增厚,肾小球系膜细胞增多,系膜基质及肾间质增生,肾小管上皮细胞胞浆出现大量空泡,管腔内可见蛋白管型。2.模型组细胞经TGF-β1刺激后,细胞形态细长,胞浆内颗粒增多,可发现巨大的融合细胞。3.黄芪注射液联合葛根素注射液能改善TGF-β1刺激后HK-2细胞的形态,下调FN蛋白质的表达。4.黄芪注射液联合葛根素注射液能够上调TGF-β1刺激后HK-2细胞中BMP-7. BMP-7R、Smad 5的mRNA表达。5.HK-2细胞Smad 5 SiRNA转染后,黄芪注射液联合葛根素注射液不能上调BMP-7的mRNA表达,可上调BMP-7R的mRNA表达,不能下调FN的mRNA表达。结论:1.黄芪注射液联合葛根素注射液可以改善DN小鼠的高血糖,减轻肾脏的病理损伤。2.黄芪注射液联合葛根素注射液可以改善肾脏纤维化。3.黄芪注射液联合葛根素注射液改善DN肾纤维化的可能的作用机理:通过上调抗纤维化细胞因子BMP-7及其受体mRNA的表达,延缓DN的发生发展并改善DN肾脏病理改变发挥作用。4.BMP-7改善DN肾脏纤维化作用可能主要通过BMP-7/Smad5通路实现。