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[目的]：构建能高效特异性抑制人原发性肝癌细胞中cFLIP基因表达的腺病毒载体；测定HepG2细胞中腺病毒载体转染的效率；检测shRNA转染后细胞cFLIP蛋白表达的情况；观察腺病毒cFLIP shRNA对细胞增殖的影响。[方法]：1.根据人cFLIP mRNA的序列,设计合成4对cFLIP基因的shRNA,将其连入干扰载体,转染HepG2,采用RT-PCR和蛋白印迹法评价基因表达情况。2.利用上述mRNA合成单链目的片段,取互补的2条单链寡核苷酸进行连接反应,根据筛选出得最佳干扰片段,构建腺病毒表达载体。3.将重组质粒转染HepG2细胞后,将筛选获得的最佳cFLIP shRNA片段进行双酶切,片段回收后连接、转化,酶切鉴定。筛选出阳性克隆,磷酸钙法转染293细胞,通过包装、扩增和纯化,获得重组腺病毒Ad5.shcFLIP,设置对照组,并进行病毒滴度测定。MTT检测对肝癌细胞HepG2的抑制率。[结果]：1. cFLIP在肿瘤细胞中的表达：利用Real time PCR检测cFLIP在肿瘤细胞中的表达,结果显示,cFLIP在肝癌细胞中高表达。2.重组质粒酶切及测序鉴定结果：经HindⅢ和BamHⅠ线性化的质粒pGenesil-1与合成的shRNA片段进行连接、转化、质粒提取后,经限制性内切酶HindⅢ和SalⅠ双酶切鉴定分析后,1%琼脂糖凝胶电泳检测,获得阳性质粒,阳性质粒送公司测序,结果完全符合设计要求。3.细胞转染效率观察：经LipofectamineTM2000脂质体转染法转染48h后,用倒置荧光显微镜观察HepG2细胞中绿色荧光蛋白报告基因的表达,以检测转染效率。荧光结果显示48h时HepG2细胞均有较强荧光表达,其转染率约为70%。4. shRNA转染后细胞cFLIP蛋白表达的检测：相同质量的shRNA载体应用脂质体2000法转染HepG2细胞(shRNA1、shRNA2、shRNA3, shRNA4, shRNAC),作用48h后进行Western blotting分析。结果显示,4对shRNA对cFLIP蛋白表达均有不同程度的抑制作用,其中抑制作用最强的是shRNA2。5.腺病毒cFLIP shRNA的纯化与干扰效果检测：经过载体构建、转染、包装、纯化获得表达cFLIP shRNA的腺病毒,获得了特异性抑制肝癌细胞中cFLIP表达的腺病毒。6.腺病毒cFLIP shRNA对细胞增殖的影响：利用MTT方法,检测其对HepG2细胞增殖的影响,结果显示表达cFLIP shRNA的腺病毒感染的HepG2细胞增殖能力较未感染cFLIP shRNA的腺病毒的HepG2细胞明显下降。实验组与对照组具有显著的差异,且二者比较差别有统计学意义(P<0.05)。[结论]：1.凋亡抑制蛋白cFLIP在肝癌细胞中高表达。2.利用线性化质粒与合成的shRNA片段连接、转化、脂质体转染后成功构建能特异且高效阻断cFLIP表_达的腺病毒。3.腺病毒cFLIP shRNA能特异性干扰肝癌细胞中cFLIP蛋白的表达。4.腺病毒cFLIP shRNA能特异性抑制肝癌细胞的增殖,为进一步研究cFLIP基因对其他肿瘤细胞增殖的影响及其临床应用奠定了基础。